病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是小儿常见的心血管疾病，柯萨奇病毒B组病毒(coxsackie virus B，CVB)是一种嗜心肌病毒，占VMC病原体的50%以上^[1]。CVB可通过免疫损失、氧化损伤等机制导致心肌细胞凋亡，使心肌细胞功能受损，参与VMC的发病^[2]。 CVB中以具有嗜心肌性的柯萨奇B3病毒(CVB3)致病性最强。研究^[3]表明：CVB病毒感染可通过PI3K途径导致Akt的磷酸化，使得PI3K-Akt信号通路失活，增加被感染心肌细胞的凋亡。本课题组的前期临床研究^[4]表明：硒可通过抑制脂质过氧化反应保护VMC患儿的心肌。研究^{[5, 6, 7]}表明:硒具有抗氧化、抗凋亡的作用，对缺血性心脏病、心肌肥大等均具有保护作用。硒是否对VMC具有抗心肌细胞凋亡作用，进而抑制VMC的发病，其作用与PI3K-Akt信号传导通路中Akt激活及其下游靶基因编码的Bax和Bcl-2蛋白关系如何，目前尚未见报道。本研究通过建立VMC小鼠模型，观察了硒减轻CVB3所致的心肌细胞凋亡的作用，以及其对PI3K-Akt信号通路活化及其下游Bcl-2和Bax蛋白表达水平的影响。

CVB3的Nancy株由吉林大学基础医学院微生物学教研室惠赠。病毒的半数组织感染量(50% tissue culture infective dose,TCID₅₀)为100/0.1 mL，－80℃保存备用。

亚硒酸钠片为北京曙光药业有限责任公司生产，维生素C为东北制药集团沈阳第一制药有限公司生产。MTT试剂盒和 TUNEL试剂盒购自上海碧云天公司，胎牛血清及DMEM12购自美国Gibco公司，鼠Akt及磷酸化Akt(p-Akt)、Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3的一抗购及二抗均购自美国Sant Cruz公司。

60只4周龄BALB/c雄性小鼠，随机分为正常对照组、病毒对照组和硒干预组，每组20只。正常对照组小鼠连续3 d腹腔注射不含病毒的培养液200μL；病毒对照组小鼠腹腔注射100 TCID₅₀ CVB3病毒液200μL,连续3 d；硒干预组小鼠在病毒对照组同样的处理后给予100 μg·kg^-1亚硒酸钠，每日1次，连续处理14 d。于第15天小鼠分别眼球后取血，断颈处死，同时沿心纵轴眼科剪切开心脏取心脏，一半10%甲醛固定待HE染色后行病理学检查，另外一半置于－80℃冰箱冻存。

常规固定、包埋、切片，HE染色后，在光镜高倍视野下，每张切片随机取5个视野，根据病变面积计算心肌病理变化程度。病变面积=每个视野中炎性细胞浸润及坏死区域面积/整个视野的面积。无病变为0分，病变面积小于25%为1分，25%～50%为2分，50%～75%为3分，大于75%为4分。最后计算心肌病变积分。

参照上海碧云天公司提供的TUNEL试剂盒说明书，病理切片给予3%H₂O₂甲醇阻断内源性过氧化物酶10 min，漂洗3次，每次5 min；蛋白酶K工作液常温20 min，漂洗5 min，重复3次；加TUNEL反应液，37℃湿盒中避光孵育60min，洗3次；含辣根过氧化物酶的抗荧光素抗体37℃湿盒中避光孵育30 min，洗3次；显色10 min，漂洗3次；苏木素复染细胞核数秒，流水冲洗，脱水，透明，中性树胶封片。阴性对照反应液中不加末端脱氧核苷酸转移酶，其他反应同前。高倍镜视野下(×400)观察切片，凋亡细胞核散大呈棕色，染色质聚集成致密的团块。随机选取5个非重叠视野，心肌细胞凋亡率=凋亡心肌细胞数/心肌细胞总数×100%。

采用组织裂解液裂解心肌组织，提取细胞总蛋白，BCA法测定浓度后，取30μg总蛋白上样电泳，电转至PVDF膜，室温封闭3h，用封闭液1∶400稀释相应一抗，4℃过夜；洗膜，用相应的HRP标记的二抗室温孵育，给予化学发光剂发光，以GIS数码凝胶成像系统分析灰度值，蛋白灰度值与β-actin灰度值的比值表示蛋白相对表达水平。

采用SPSS18.0软件进行统计学分析。小鼠生存率组间比较采用χ²检验。各组小鼠心肌病理积分、心脏质量/体质量比、心肌细胞凋亡率及Akt、p-Akt、Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3蛋白表达水平以x[TX-]±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

正常对照组小鼠状态良好，无死亡；病毒对照组小鼠14d生存率为60.0%(12/20)，硒干预组小鼠14d生存率为85.0%(17/20)。与病毒对照组比较，硒干预组小鼠生存率明显提高(P<0.01)。正常对照组小鼠心肌组织未见明显病变；其他2组小鼠心肌组织均可见典型的病毒性心肌炎的病理学改变，其中病毒对照组小鼠心肌组织可见片状及弥漫性炎性细胞浸润，心肌纤维断裂和局灶性坏死，硒干预组较病毒对照组轻，炎性细胞浸润少，坏死灶小且减少。各组小鼠心肌病理学积分和心脏质量/体质量比组间比较差异均有统计学意义(P<0.01)。见表 1。

病毒对照组小鼠心肌细胞凋亡率为(51.23±2.41)%，硒干预组小鼠的心肌细胞凋亡率为(24.89±2.13)%，二者比较差异有统计学意义(P<0.01)，提示硒能减轻CVB3感染所致的心肌细胞凋亡。

与正常对照 组比较，病毒对照组小鼠心肌细胞Bax、 Cleaved caspase-3蛋白表达水平明显增高，而Bcl-2蛋白表达下降，Bax/Bcl-2蛋白比值明显增加，差异均有统计学意义(P<0.01)。与病毒对照组比较，硒干预组小鼠心肌细胞Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达明显降低(P<0.01)；p-Akt、Bcl-2蛋白表达增加(P<0.01)，Bax/Bcl-2蛋白比值下降(P<0.01)，提示硒可通过增加Akt的磷酸化，继而调控Bax/Bcl-2蛋白的表达，从而减少CVB3病毒感染的心肌细胞凋亡发生。见图 1和表 2。

图 1 各组小鼠心肌细胞中Akt、p-Akt、Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3蛋白表达电泳图 Fig.1 Electrophoregram of expressions of Akt,p-Akt,Bax,Bcl-2 and Cleaved caspase-3 in myocardial cells of mice in various groups Lane 1: Normal control group;Lane 2: Virus control group;Lane 3: Selenium intervention group.

图选项

已有研究^[2]证实：CVB所致的VMC与自身免疫学炎症反应、病毒直接杀伤以及诱导凋亡有关。在不同细胞环境中，PI3K-Akt信号通路的抑制是宿主细胞活性减少的重要原因^[8]。研究^[5]发现：硒具有明显的抗凋亡生物学效应。硒对CVB3感染的心肌细胞的凋亡抑制作用尚未明确。本研究以CVB3感染的小鼠心肌炎模型为研究对象，观察硒对CVB3感染心肌炎小鼠的保护作用，检测各组心肌细胞PI3K-Akt信号传导通路中Akt、p-Akt及其下游靶基因编码的Bax和Bcl-2蛋白表达变化，探讨硒是否通过PI3K-Akt信号通路及其下游蛋白Bcl-2、Bax发挥对CVB感染导致VMC小鼠的保护作用。

本研究中TUNEL检测结果表明：病毒对照组小鼠心肌细胞凋亡发生率较正常对照组明显增高，而硒干预组小鼠心肌细胞凋亡率下降51.43%。当心肌细胞受到病毒侵袭时，一方面可激活凋亡程序，通过牺牲感染细胞达到清除病毒的作用；另一方面，病毒也可调控凋亡相关基因的表达，调控心肌细胞的凋亡^[9]。可以看出硒对CVB3感染导致的心肌损伤具有保护作用，能抑制其诱导的心肌细胞凋亡。与病毒对照组比较，硒干预组小鼠心肌细胞p-Akt、Bcl-2表达上升，Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达下降。PI3K-Akt信号通路在细胞的存活、增殖以及凋亡等过程中发挥重要的生物学作用^[10]。激活的PI3K可直接使下游靶分子Akt磷酸化，从而使Akt激活；Akt-Ser的473位点磷酸化是Akt激活的必要条件，因而p-Akt蛋白与总Akt蛋白比值可表示Akt的活化程度^[11]。激活的Akt通过与下游效应分子结合，影响其下游的多种效应分子如Bax、Bcl-2等而发挥其抗凋亡作用^[12]。PI3K/Akt信号途径的激活可有效地保护心肌细胞^{[13, 14]}。病毒对照组小鼠心肌组织Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达增加，而Bcl-2蛋白被抑制，这一结果与文献[15]报道一致。研究^[16]表明：CVB3感染可促进线粒体凋亡途径的细胞色素C释放，活化caspase-3，启动凋亡级联反应。线粒体凋亡途径主要由Bax、Bcl-2等Bcl-2家族调控，能够通过改变线粒体外膜的通透性来促进或者抑制细胞色素C和其他凋亡因子的释放^{[17, 18, 19]}。caspase-3是执行凋亡的关键蛋白，其主要表现在凋亡的最后阶段，负责水解机体许多核心蛋白，最终引起细胞的形态学改变。本研究结果提示：硒对CVB3感染导致的VMC小鼠心肌细胞有一定的保护作用，其作用机制与硒通过活化PI3K-Akt信号通路，并调控其下游Bcl-2和Bax蛋白表达，继而抑制caspase-3的裂解，抑制凋亡有关。

综上所述，本研究表明：硒可通过调控PI3K-Akt信号通路及其下游蛋白Bcl-2、Bax的表达，抑制CVB3诱导的心肌细胞凋亡，对CVB3感染的VMC小鼠发挥心肌保护作用，硒是否对其他凋亡途径有调节作用，尚待进一步研究。