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文章信息
- 黄晓东, 沈楠, 路倩, 刘微, 常影, 范红艳, 王艳春
- HUANG Xiaodong, SHEN Nan, LU Qian, LIU Wei, CHANG Ying, FAN Hongyan, WANG Yanchun
- 黄芪甲苷对糖尿病肾脏病变大鼠氧自由基代谢和转化生长因子β1mRNA表达的影响
- Effect of astragaloside on oxygen radical metabolism and expression of TGF-β1 mRNA in diabetic nephropathic rats
- 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(01): 48-53
- Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2016, 42(01): 48-53
- 10.13481/j.1671-587x.20160110
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文章历史
- 收稿日期: 2015-06-03
2. 吉林医药学院机能实验中心, 吉林吉林 132013
2. Experimental Center, Jilin Medical College, Jilin 132013, China
糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是一种由糖尿病引起的微血管病变导致的肾小球硬化的慢性并发症[1],其发病率高,危害性大,其发生机制尚不清楚。目前认为氧自由基(reactive oxygen species,ROS)在DN的发生发展中起主要作用,糖尿病的慢性并发症都与自由基所致机体蛋白质的氧化损伤有关[2, 3]。转化生长因子β1 (transforming growth factor β1,TGF-β1)是得到广泛认可的致纤维化因子,在DN发病机制中起重要作用,TGF-β1通过促进ECM沉积、肾小球基底膜增厚等途径参与DN肾小球硬化、肾小管间质纤维化的发生[4, 5]。黄芪 又名黄耆,《本草纲目》中记载其“甘纯阳,可补诸虚不足,壮脾胃,活血生血”,具有补气升阳、固表止汗、行水消肿和托毒生肌的功效[6]。黄芪甲苷(astragaloside Ⅳ,As Ⅳ)是其主要皂苷类成分之一,大量研究[7, 8]表明:黄芪甲苷具有免疫调节、抗氧化、抗缺血性脑损伤、抗衰老和促智等作用,并在对DN的治疗上得到广泛的认可。目前临床所用的大多数治疗DN的药物作用单一,特异性较低,不良反应较大,疗效不理想。因此,研究黄芪甲苷对DN的防治作用,并阐明其作用机制,对开发DN的治疗药物有重要意义。本实验以链脲佐菌素(STZ)制备DN大鼠模型,观察黄芪甲苷对DN大鼠氧自由基代谢的影响,并且探讨黄芪甲苷抗氧化作用及肾脏保护作用的机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物Wistar大鼠60只,雄性,SPF级,体质量(200±30)g,购于吉林大学动物实验中心,动物合格证号:SCXK(吉)2010-0001;鼠高脂饲料[9](脂肪22%,蛋白质20%,碳水化合物48%,纤维素、水等其他成分10%,热量为44.3kJ·kg-1),购于吉林大学动物实验中心。
1.2 药物、主要试剂和仪器黄芪甲苷购于上海医药发展有限公司,STZ(批号 S0150)购于美国Sigma公司,厄贝沙坦片(Irbesartan,国药准字J20120042)购于赛诺菲(北京)制药有限公司, 超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、血肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)试剂盒购于南京建成生物工程研究所,总RNA提取试剂盒和反转录PCR试剂盒购于美国Promega公司,过氧化氢酶(CAT)、TGF-β1和β-actin引物由上海生工生物工程有限公司提供。稳豪型血糖仪,强生(中国)有限公司;BECKMAN CX7全自动生化分析仪,美国贝克曼公司;2000C紫外分光光度计,美国Thereto Scientific公司;酶标仪,北京市六一仪器厂;实时定量PCR仪,美国Illumina公司。
1.3 动物模型建立及分组[9, 10]Wistar大鼠按体质量随机分为6组,每组10只,分别为正常对照组、模型组、低剂量(0.75 mg·kg-1)黄芪甲苷组、中剂量(1.50 mg·kg-1)黄芪甲苷组、高剂量(3.00 mg·kg-1)黄芪甲苷组和厄贝沙坦(14.37 mg·kg-1)组。除正常对照组外,各组大鼠腹腔注射STZ 60 mg·kg-1(溶于0.1 mmol·L-1的构椽酸-柠檬酸钠缓冲液,pH 4.5,新鲜配制),正常对照组注射同等体积的构椽酸缓冲液,72 h后检测大鼠尾静脉空腹血糖(FBG)大于16.7 mmol·L-1时,为糖尿病大鼠模型构建成功。随后各组大鼠给予相应药物每日灌胃1次,正常对照组大鼠灌相应剂量双蒸水。正常对照组大鼠用普通饲料喂养,其余各组大鼠给予高脂饲料喂养。8周后,检测大鼠血糖,代谢笼收集大鼠尿液检测24 h尿蛋白量;FBG大于16.7 mmol·L-1、24 h尿蛋白量大于30 mg·kg-1·d-1,确定为糖尿病大鼠出现肾脏病变[11, 12],即DN模型制备成功。各组大鼠禁食12 h,腹腔注射乌拉坦100 mg·kg-1麻醉,腹主动脉取血4mL,取肾脏,放于-80℃冰箱冷冻保存。
1.4 大鼠肾功能生化指标检测第8周末,禁食12 h,大鼠剪尾静脉取血,用稳豪型血糖仪检测FBG,腹主动脉取血4 mL,放置30 min,3000 r·min-1离心10 min,分离血清,全自动生化分析仪检测SCr、BUN,代谢笼收集24 h尿量,考马斯亮兰检测24 h尿蛋白量[13]。
1.5 大鼠肾组织SOD、MDA水平和GSH-Px活性检测 [14]取肾皮质部0.5 g,冰冷生理盐水漂洗,去血液,冰浴条件下,以9∶1的质量比,用生理盐水制成10%的组织匀浆,3000 r·min-1低温离心10 min,取上清,采用硫代巴比妥酸反应法检测MDA水平,采用硝酸还原酶法检测 NO水平,采用比色法检测GSH-Px活性,严格按照试剂盒说明书操作。
1.6 大鼠肾组织CAT和TGF-β1 mRNA表达水平检测采用RT-PCR法[15]检测各组大鼠肾组织CAT和TGF-β1 mRNA 表达水平。取大鼠肾皮质50 mg匀浆,按TRIzol试剂盒说明书操作,抽提组织总RNA,灭活逆转录酶,扩增引物由上海生工生物工程有限公司合成,内参照β-actin引物序列,上游引物5′-CAGCACTGTGTTGGGTGG-3′,下游引物5′-AAGATCCTGACCGAGCGTGG-3′,引物扩增产物长度315 bp;CAT引物序列,上游引物5′-GTCCCCATATTGATGGAC-3′,下游引物5′-GTTCCGAGGCCGCCGCGCGT-3′,引物扩增产物长度297 bp;TGF-β1引物序列,上游引物5′-TGAGTGGCTGTCTTTTGACG-3′,下游引物5′-TGGTTGTAGAGGGCAAGGAC-3′,引物扩增产物长度456 bp;取PCR产物进行PCR扩增,电泳,以β-actin为内参照,用凝胶成像分析系统进行半定量分析,以光密度(A)比值表示mRNA 表达水平。
1.7 统计学分析采用SPSS11.5软件进行统计学分析。大鼠肾功能生化指标,肾组织中SOD、MDA水平和GSH-Px活性,CAT和TGF-β1 mRNA表达水平,均以x±s表示,组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果 2.1 各组大鼠肾功能生化指标实验8周后,与正常对照组比较,模型组大鼠血清中SCr、BUN、FBG水平和24h尿蛋白量明显升高(P<0.01);与模型组比较,各剂量黄芪甲苷组和厄贝沙坦组大鼠血清中Scr降低(P<0.05或 P<0.01);中、高剂量黄芪甲苷组和厄贝沙坦组大鼠血清中BUN、FBG水平和24h尿蛋白量降低 (P<0.05或P<0.01)。见表 1。
(n=10,x±s ± s) | ||||
Group | FBG[cB/(mmol·L-1)] | SCr [cB/(μmol·L-1)] | BUN [cB/ (mmol·L-1)] | 24h urinary protein(m/mg) |
P<0.01 vs control group;△P<0.05, △△P<0.01 vs model group | ||||
Control | 5.74±1.24 | 36.58±6.74 | 8.97±1.32 | 11.23±5.26 |
Model | 28.71±5.17* | 127.84±54.57* | 33.24±9.31* | 367.57±135.26* |
AstragalosideⅣ(mg·kg-1) | ||||
0.75 | 25.94±6.02 | 104.25±53.18△ | 30.06±8.73 | 356.24±120.11 |
1.50 | 24.31±5.35△ | 96.64±34.33△△ | 25.38±7.88△ | 301.27±98.92△ |
3.00 | 24.52±4.07△ | 78.72±41.65△△ | 20.17±7.45△△ | 306.15±102.53△ |
Irbesartan | 22.11±4.12△ | 72.37±34.66△△ | 19.83±6.35△△ | 279.45±97.25△△ |
与正常对照组比较,模型组大鼠肾组织中SOD和GSH-Px活性降低(P<0.01),MDA水平升高(P<0.05);灌胃8周后,与模型组比较,中、高剂量黄芪甲苷组和厄贝沙坦组大鼠肾组织中SOD活性升高 (P<0.05或P<0.01 ),MDA水平降低(P<0.05或P<0.01),各剂量黄芪甲苷组和厄贝沙坦组大鼠肾组织中GSH-Px活性均升高(P<0.05或P<0.01)。见表 2。
(n=10,x±s ± s) | |||
Group | SOD [ρB/(mg·L-1)] | GSH-Px [ρB/(mg·L-1)] | MDA [cB/(mol·L-1)] |
P<0.05, ** P<0.01 vs control group; △P<0.05, △△P<0.01 vs model group. | |||
Control | 77.28±15.34 | 16.48±3.70[]15.12±1.06 | |
Model | 38.14±3.41** | 5.32±1.48** | 21.57±1.54* |
AstragalosideⅣ(mg·kg-1) | |||
0.75 | 42.71±17.64 | 7.53±1.56△ | 21.02±3.17 |
1.50 | 57.40±15.22△ | 7.32±1.83△ | 17.37±2.24△ |
3.00 | 59.49±10.08△△ | 11.24±1.41△△ | 16.52±1.38△ |
Irbesartan | 72.31±8.56△△ | 10.27±1.22△△ | 14.61±1.02△△ |
与正常对照组比较,模型组大鼠肾组织中TGF-β1和CATmRNA表达水平明显升高 (P<0.05 或P<0.01);与模型组比较,厄贝沙坦组和中、高剂量黄芪甲苷组大鼠肾组织中TGF-β1 mRNA表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01),CAT mRNA表达水平有所降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。见表 3和图 1。
(n=10,x±s ± s) | ||
Group | TGF-β1 mRNA | CAT mRNA |
*P<0.05, **P<0.01 vs control group; △P<0.05, △△P<0.01 vs model group. | ||
Control | 0.24±0.04 | 0.73±0.26 |
Model | 0.92±0.34** | 0.94±0.32* |
Astragaloside Ⅳ(mg·kg-1) | ||
0.75 | 0.87±0.22 | 0.82±0.24 |
1.50 | 0.75±0.23△ | 0.75±0.28 |
3.00 | 0.71±0.28△△ | 0.75±0.21 |
Irbesartan | 0.69±0.31△△ | 0.69±0.22 |
DN是糖尿病患者最常见的并发症,DN早期会出现尿蛋白,随着病情发展尿蛋白随之增加,进而发展为肾小球滤过膜损伤及肾间质的纤维化,导致肾小球的硬化,形成不可逆转的肾脏损害[16]。近几年来,氧化应激在DN发生和发展中的作用受到广泛关注。研究[17]表明:氧化应激是糖尿病慢性并发症的主要发病机制之一,是DN的主要致病因素。有研究[18, 19]发现:黄芪甲苷对DN大鼠肾组织及肾小球系膜细胞氧化应激损伤有保护作用。本研究以STZ制备的DN大鼠模型为研究对象,观察黄芪甲苷对DN大鼠模型肾脏病变的保护机制。
糖尿病状态下,以肾组织中糖代谢紊乱为主的多种因素综合造成肾组织中氧自由基(ROS)、过氧化物等产物产生过多。中药黄芪的有效成分黄芪甲苷可使糖尿病大鼠肾脏组织中增高的一氧化氮合成酶下降,抑制肾脏组织中一氧化氮的产生,可以减轻糖尿病大鼠肾脏组织中病理改变,改善肾功能[20]。本研究结果表明:STZ伴高脂饲料喂养所致的DN模型大鼠,其血清中SCr、BUN、FBG和24h尿蛋白量均较正常对照组明显升高,黄芪甲苷各剂量组上述指标均较模型组有明显改善,提示黄芪甲苷可以降低STZ所致DN模型大鼠血清中Scr、BUN、FBG和24h尿蛋白量水平,改善肾功能,减少肾损伤。这与前期报道相似[21, 22]。大量研究[23]显示:DN的肾微血管病变是在高血糖环境下,活性氧生成过多而导致肾组织细胞中发生的氧化应激损伤,DN的发生与体内氧化应激密切相关。氧自由基是机体正常代谢的中间产物,可以由组织细胞内的 SOD和CAT 等清除。在DN过程中,体内氧自由基可以由多种原因使其生成增多,同时SOD和CAT等出现生成不足或活性降低,引起组织对氧自由基的清除能力下降,组织细胞内氧自由基大量产生和堆积,损伤肾组织。有研究[24]报道:糖尿病大鼠肾组织中SOD和GSH-Px活性较对照组显著降低,这与本实验结果相符,说明随着糖尿病的病程延长,体内的抗氧化酶系统活性逐渐下降,最终引起肾组织中氧化应激的产生。本研究结果显示:模型组大鼠肾组织中MDA 水平较正常对照组明显增加,而SOD水平则明显下降,同时肾组织中GSH-Px活性也明显低于正常对照组,提示模型组大鼠肾组织中抗氧化能力缺损,肾组织中氧自由基生成与清除失衡,这可能与STZ引起的氧化损伤及高脂饲料喂养使活性氧产生和过氧化脂质形成增加,导致细胞膜及膜性结构上不饱和脂肪酸氧化,肾组织脂质沉积增加有关;黄芪甲苷1.50和3.00 mg·kg-1组大鼠肾组织中脂质过氧化产物MDA水平降低,抗氧化酶SOD水平和GSH-Px活性明显增加,SOD、CAT和 GSH-Px的主要作用分别是清除超氧阴离子(O2- )和H2O2,MDA是自由基作用于脂质发生过氧化反应后的氧化终产物,在黄芪甲苷干预后,DN 大鼠肾组织中抗氧化酶 SOD水平和GSH-Px活性提高,MDA水平降低,与厄贝沙坦作用大致相当,表明黄芪甲苷可以减少DN大鼠体内 ROS数量,增强机体清除ROS能力,减弱氧自由基对肾组织细胞造成的氧化应激损伤,具有保护肾组织细胞的作用。
细胞中ROS产生增多时,可引起线粒体DNA氧化损伤,激活聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP),使磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)活性下降,阻断葡萄糖正常代谢,激活糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)途径等,这就是引发DN在内的糖尿病慢性并发症的机制[25]。有研究[26]表明:AGEs与AGE受体结合后,引起血管内皮生长因子(VEGF)和血管细胞黏附分子1(VCAM-1)表达增加,肾小球内单核巨噬细胞增多,通过活性氧簇、环氧合酶等途径促进TGF-β1表达增加,导致系膜增生、基底膜增厚,出现肾小球硬化及蛋白尿。本研究结果显示:模型组大鼠肾组织TGF-β1mRNA的表达水平明显高于正常对照组,而黄芪甲苷1.50和3.00 mg·kg-1组大鼠肾组织TGF-β1 mRNA的表达水平则较模型组明显降低,提示黄芪甲苷可以降低DN大鼠肾组织TGF-β1 mRNA表达,减少肾组织损伤重构,改善大鼠肾功能。CAT可以清除超氧阴离子和H2O2,模型组大鼠肾组织中CAT mRNA 表达水平升高,可能是由于DN模型组OS产物对酶活性产生抑制而出现酶活性基团一种代偿性升高所致[27, 28, 29]。黄芪甲苷和厄贝沙坦干预后,CAT mRNA 表达水平有所下降,但差异无统计学意义,其原因可能是与CAT酶蛋白活性基团受抑有关,具体机制有待进一步研究。
综上所述,黄芪甲苷可以降低STZ所致的DN大鼠血清中BUN、SCr水平及肾组织中MDA水平,提高SOD水平和GSH-Px抗氧化酶的活性,抑制肾组织中TGF-β1mRNA表达,减轻DN时细胞因子与氧化应激相互促进的恶性循环,从而起到肾组织保护的作用。
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