吉林大学学报(医学版)  2016, Vol. 42 Issue (01): 40-47

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张博男, 张静怡, 储金秀, 王树华, 韩淑英
ZHANG Bonan, ZHANG Jingyi, CHU Jinxiu, WANG Shuhua, HAN Shuying
荞麦花叶芦丁对高糖刺激血管损伤的保护作用
Protective effect of rutin from buckwheat flowers and leaves on vascular injury induced by high glucose stimulation
吉林大学学报(医学版), 2016, 42(01): 40-47
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2016, 42(01): 40-47
10.13481/j.1671-587x.20160109

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收稿日期: 2015-06-14
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张博男, 张静怡, 储金秀, 王树华, 韩淑英. 荞麦花叶芦丁对高糖刺激血管损伤的保护作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(01): 40-47.
ZHANG Bonan, ZHANG Jingyi, CHU Jinxiu, WANG Shuhua, HAN Shuying. Protective effect of rutin from buckwheat flowers and leaves on vascular injury induced by high glucose stimulation[J]. Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2016, 42(01): 40-47.
荞麦花叶芦丁对高糖刺激血管损伤的保护作用
张博男1, 张静怡2, 储金秀1, 王树华1, 韩淑英1     
1. 华北理工大学基础医学院药理学系河北省慢性疾病重点实验室唐山市慢性病临床基础研究重点实验室, 河北唐山 063000;
2. 河北省唐山市工人医院心内四科, 河北唐山 063000
收稿日期: 2015-06-14
基金项目: 河北省科技厅自然科学基金资助课题(C2010001795);河北省唐山市科技局科技计划项目资助课题(14130224a);河北联合大学科学研究基金项目资助课题(Z201325)
作者简介: 张博男(1982-),男,黑龙江省佳木斯市人,讲师,在读医学博士,主要从事中药防治糖尿病及心血管系统疾病方面的研究。
通信作者: 韩淑英,教授,硕士研究生导师(Tel:0315-3725870,E-mail:hsy1959@126.com)
摘要: 目的: 观察荞麦花叶芦丁(RBFL)对高糖所致血管损伤的保护作用,并探讨其可能机制。 方法: 45只SD大鼠随机取出8只作为正常对照组,其余37只空腹一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ,60 mg·kg-1)建立1型糖尿病动物模型。将造模成功大鼠分为模型组 (n=10)和低剂量(45 mg·kg-1,n=8)、中剂量(90 mg·kg-1,n=8)及高剂量(180 mg·kg-1,n=8)RBFL干预组,灌胃给药,每天1次,连续8周;正常对照组和模型组大鼠灌胃等量生理盐水。给药8周后观察各组大鼠的一般状况,记录血糖和体质量,检测不同浓度乙酰胆碱 (Ach)(1×10-9~1×10-5 mol·L-1)和硝普钠 (SNP)(1×10-10~1×10-5 mol·L-1)诱导的各组大鼠胸主动脉血管舒张率,检测各组大鼠血清中氧自由基(ROS)、一氧化氮(NO)水平和超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽-过氧化物酶(GSH-Px)及总一氧化氮合酶(tNOS)活性。正常大鼠处死并迅速分离胸主动脉,分为正常葡萄糖对照组(11 mmol·L-1 葡萄糖),高浓度葡萄糖损伤(HG)组(44 mmol·L-1 葡萄糖),低剂量RBFL(0.2 mg·L-1)、中剂量RBFL(0.4 mg·L-1)和高剂量RBFL(0.8 mg·L-1)处理组,HG+亚硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)组,HG+L-NAME+RBFL组,HG+亚甲蓝(MB)组,HG+MB+RBFL组(n=6)。检测不同浓度Ach 和SNP诱导的各组大鼠胸主动脉血管舒张率,检测正常葡萄糖对照组、HG和RBFL处理组大鼠胸主动脉组织中SOD和NOS活性。 结果: 与正常对照组比较,模型组大鼠体质量下降,血糖升高(P<0.01);与模型组比较,RBFL干预组大鼠体质量升高,血糖降低(P<0.05或P<0.01)。与正常对照组比较,模型组大鼠胸主动脉Ach诱导的血管舒张率降低(P<0.05或P<0.01);与模型组比较,RBFL干预组Ach诱导的血管舒张率均升高(P<0.05或P<0.01),且该作用可被L-NAME和MB所取消;各组大鼠SNP诱导的血管舒张率比较差异无统计学意义(P>0.05)。与正常对照组比较,模型组大鼠血清ROS水平升高(P<0.01),NO水平及SOD和NOS活性降低(P<0.01);与模型组比较, 高剂量RBFL干预组大鼠血清ROS水平降低(P<0.01), NO水平及SOD和NOS活性升高(P<0.01)。各组大鼠血清GSH-Px活性比较差异无统计学意义(P>0.05)。与正常葡萄糖对照组比较,HG组大鼠Ach诱导的胸主动脉血管舒张率降低(P<0.01);与HG组比较,不同剂量RBFL(0.2、0.4和0.8 mg·L-1)处理组大鼠Ach诱导的血管舒张率均升高(P<0.05或P<0.01),且该作用可被L-NAME和MB所取消;各组大鼠SNP诱导的血管舒张率比较差异无统计学意义(P>0.05)。与正常葡萄糖对照组比较,HG组大鼠血管组织中SOD和tNOS活性下降(P<0.01);与HG组比较,高剂量RBFL 处理组大鼠血管组织中SOD和tNOS活性升高(P<0.01)。 结论: RBFL慢性整体给药和急性处理可以有效改善小鼠高糖刺激血管内皮依赖性舒张功能,其保护作用与增强血管SOD活性、减少ROS过量生成及促进血管内皮细胞合成NO有关。
关键词: 荞麦芦丁    高糖血管损伤    氧化应激    血管内皮    一氧化氮    血管舒张    
Protective effect of rutin from buckwheat flowers and leaves on vascular injury induced by high glucose stimulation
ZHANG Bonan, ZHANG Jingyi, CHU Jinxiu, WANG Shuhua, HAN Shuying     
1. Department of Pharmacology, School of Basic Medical Sciences, North China University of Science and Technology, Hebei Key Laboratory for Chronic Diseases, Tangshan Key Laboratory for Preclinical and Basic Research on Chronic Diseases, Tangshan 063000, China;
2. Department of Cardiology, Tangshan Gongren Hospital, Hebei Province, Tangshan 063000, China
Abstract: Objective: To observe the protective effect of rutin from buckwheat flowers and leaves (RBFL)on the vascular injury induced by high glucose stimulation,and to explore the possible mechanism.Methods: Eight rats were randomly selected from forty-five SD rats and used as control group,the last were used to induce the type Ⅰ diabetes mellitus model with STZ (60 mg·kg-1,i.p.). The successful model rats were divided into model group (n=10),low dose (45 mg·kg-1)of RBFL group,moderate dose (90 mg·kg-1)of RBFL group and high dose (180 mg·kg-1)of RBFLgroup (n=8). The rats in RBFL groups were gavaged the corresponding doses of RBFL once a day for 8 weeks;the rats in control group and model group were gavaged the same volume saline. The general condition was observed after 8 weeks;the blood glucose and body weight were recorded;the vessel relaxant rates of thoracic aortas induced by acetylcholine (Ach)(10-9-10-5 mol·L-1)and sodium nitroprusside (SNP)(10-10-10-5 mol·L-1)of the rats in various groups were detected;the serum reactive oxygen species (ROS)level,nitric oxide (NO)level,and superoxide dismutase (SOD),glutathione peroxidase (GSH-Px)and total nitric oxide synthase (tNOS)activities of the rats in various groups were detected. The thoracic aortas were separated rapidly from the normal rats and divided into normal glucose group (11 mmol·L-1 glucose),high glucose(HG)group (44 mmol·L-1 glucose),low RBFL(0.2 mg·L-1)group,moderate RBFL(0.4 mg·L-1)group,high RBFL(0.8 mg·L-1)group,HG+ NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)group,HG+L-NAME +RBFL group,HG+methylene blue (MB)group,and HG+MB +RBFL group. The vessel relaxant rates of thoracic aortas of the rats in various groups induced by Ach and SNP were detected;the SOD and NOS activities in thoracic aortas of the rats in normal group,HG group and RBFL group were detected.Results: Compared with control group,the body weights of the rats in model group were decreased and the blood glucose was increased (P<0.01);compared with model group,the body weights of the rats in RBFL group were increased and the blood glucose was decreased (P<0.05 or P<0.01);compared with control group,the vessel relaxant rate induced by Ach in model group was decreased (P<0.05 or P<0.01);compared with model group,the vessel relaxant rates induced by Ach in RBFL groups were increased (P<0.05 or P<0.01)and the effect was cancelled by L-NAME and MB,while the SNP-induced vessel relaxant rates had no changes (P>0.05). Compared with control group,the level of serum ROS in model group was increased(P<0.01);the NO level,the SOD and NOS activities were decreased(P<0.01).Compared with model group,the level of serum ROS in high RBFL group was decreased;the NO level,the activities of SOD and tNOS were increased (P<0.01),but the serum GSH-Px activity had no changes (P>0.05). Compared with normal glucose group,the vessel relaxant rate induced by Ach in HG group was decreased (P<0.01);compared with HG group,the vessel relaxant rates induced by Ach in RBFL groups were increased (P<0.05 or P<0.01)and the effect was cancelled by L-NAME and MB,while the SNP-induced vessel relaxant rate had no changes (P>0.05).Compared with normal glucose group,the SOD and NOS activities in HG group were decreased (P<0.01);compared with HG group,the activities of SOD and tNOS in high RBFL group were increased (P<0.01). Conclusion: RBFL could improve the endothelium-dependent vasorelaxation in high glucose injury of the rats and the mechanism may be related to enhancing the SOD activity,reducing the ROS generation and promoting the NO synthesis of endothelium cells.
Key words: rutin from buckwheat flowers and leaves    high glucose vascular injury    oxidative stress    endothelium    nitric oxide    vasorelaxation    

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是胰岛素分泌缺陷或(及)胰岛素作用缺陷所引起的糖、脂肪及蛋白质代谢紊乱的慢性代谢性疾病，可以大大增加患者心血管疾病的发生率，心血管疾病已经成为DM最主要的并发症之一[1]。DM导致血管病变的机制非常复杂，其中高血糖诱发的活性氧自由基(ROS)过量生成、体内抗氧化系统活性降低是DM血管内皮损伤的促进因素[2]；减少高血糖诱发的氧化应激及提高抗氧化酶活性可能是改善DM血管功能的有效方法。荞麦主要分布在我国东北地区，其化学成分主要含有芦丁和槲皮素等黄酮类化合物。本研究室前期研究[3, 4]发现：荞麦花叶总黄酮具有降糖、降脂、改善糖耐量及舒张血管等活性，其主要成分芦丁对大鼠糖尿病心肌病和心肌梗死亦有明显的保护作用，但是否可以改善高糖刺激血管的内皮依赖性舒张功能目前尚未见报道。由于血管内皮功能紊乱在DM早期即可出现[5]，本实验分别从体内和体外角度观察荞麦花叶芦丁(rutin from buckwheat flowers and leaves,RBFL) 对高糖刺激血管内皮损伤的影响，并探讨其可能机制。

1 材料与方法 1.1 实验动物、药物和主要试剂

健康SD大鼠，体质量(200±20)g，动物合格证号：SCXK(京)2009-004，由中国医学科学院实验动物研究所提供，于华北理工大学实验动物中心饲养。 RBFL为自制[6]，经本校中药学系确认。链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)、苯肾上腺素(phenylephrine,PE)、乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)、左旋硝基精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-argininemethyl ester hydrochloride,L-NAME)、亚甲蓝(methylene blue,MB)和硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)均购自美国Sigma公司。ROS荧光探针DCFH-DA购自江苏碧云天生物技术研究所。一氧化氮(nitric oxide,NO)试剂盒、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)试剂盒和谷胱甘肽-过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。其余试剂为巿售分析纯。克氏液成分(K-H液，mmol·L-1)：NaCl 118.0，KCl 4.7，KH2PO4 1.2，MgSO4 1.2，NaHCO3 25.0，CaCl2 1.25，葡萄糖11.0，pH 7.4。在高浓度葡萄糖K-H液中，葡萄糖为44 mmol·L-1，其余成分不变。

1.2 DM模型制备及分组给药

45只大鼠适应性喂养1周，随机取出8只为正常对照组(control)。其余37只大鼠空腹一次性腹腔注射STZ (60 mg·kg-1)诱导1型DM动物模型[7]，正常对照组注射相同剂量的柠檬酸钠缓冲液。72 h后尾静脉取血检测空腹血糖(FBG)，FBG≥11.1 mmol·L-1者定为DM模型动物[4]。造模成功大鼠共34只，分为模型组(model)10只及低剂量(45 mg·kg-1)、中剂量(90 mg·kg-1)、高剂量(180 mg·kg-1) RBFL干预组[4]，每组8只，灌胃给药，每天1次，连续8周；正常对照组和模型组大鼠灌胃等量的生理盐水。记录给药8周后各组大鼠的血糖和体质量变化。

1.3 Ach诱导的DM大鼠胸主动脉舒张实验

将各组大鼠处死，分离胸主动脉，置于通混合气体(95% O2，5% CO2)的4℃ K-H液中，去除周围结缔组织后将血管剪成约3~4 mm宽的血管环(避免因过度牵拉造成内皮损伤)。将血管环放入含K-H液的浴槽内，持续通以混合气体(95% O2，5% CO2)并保持37℃恒温。先以0.5 g张力稳定30 min，然后逐步调节张力至2 g，每隔20 min换液1次，平衡1 h后开始实验。加入60 mmol·L-1 KCl刺激，待收缩幅度达到峰值后洗脱3次，以激发主动脉环最大收缩。待主动脉环稳定后，在浴槽中加入1 μmol·L-1 PE (根据实验需要，在加入PE前30 min加入0.1 mmol·L-1 L-NAME或0.01 mmol·L-1 MB孵育)，收缩达到峰值后累积加入Ach (1×10-9~1×10-5 mol·L-1)，检测各组大鼠胸主动脉对Ach诱导的内皮依赖性舒张反应。设定PE引起的最大收缩幅度为100%，以加入Ach后的血管张力幅度与PE诱发最大收缩幅度之间的比值反映血管的舒张性能。血管舒张率=(PE诱发的最大张力－ACh相应浓度时的张力)/PE诱发的最大张力×100%。

1.4 SNP诱导的DM大鼠胸主动脉舒张实验

按照1.4的方法，待动脉环稳定后，在浴槽中加入0.1 mmol·L-1 L-NAME孵育30 min，然后加入1 μmol·L-1 PE，收缩达到峰值后累积加入SNP(1×10－10~1×10－5 mol·L-1)，检测各组胸主动脉对SNP诱导的非内皮依赖性舒张反应。设定PE引起的最大收缩幅度为100%，以加入SNP后的血管张力幅度与PE诱发最大收缩幅度之间的比值反映血管的舒张性能。血管舒张率=(PE诱发的最大张力－SNP相应浓度时的张力)/PE诱发的最大张力×100%。

1.5 DM大鼠血清ROS、NO水平和SOD、GSH-Px及NOS活性检测

各组大鼠饲养8周后，用4%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，3 000 r·min-1、4℃离心15 min，取上清液备用。按试剂盒操作说明书测定各组血清ROS、NO水平和SOD、GSH-Px及NOS活性。

1.6 RBFL急性给药实验分组及药物处理

正常大鼠处死并迅速分离胸主动脉，在Organ bath系统中稳定并检测内皮完整性之后，取内皮完整的血管环于不同K-H液中孵育4 h，分为9组，每组6根血管环。①正常葡萄糖对照组(control):11 mmol·L-1 葡萄糖；②高浓度葡萄糖损伤组(HG):44 mmol·L-1 葡萄糖；③低剂量(0.2 mg·L-1)RBFL处理组(HG+low RBFL)；④中剂量(0.4 mg·L-1)RBFL处理组(HG+moderate RBFL)；⑤高剂量(0.8 mg·L-1)RBFL处理组(HG+high RBFL)[3]；⑥高浓度葡萄糖+L-NAME组(HG+L-NAME)；⑦高浓度葡萄糖+L-NAME+RBFL组(HG+L-NAME+ high RBFL)；⑧高浓度葡萄糖+MB组(HG+MB)；⑨高浓度葡萄糖+MB+RBFL组(HG+MB+ high RBFL)。RBFL在孵育的最后30 min内加入，L-NAME(0.1 mmol·L-1)和MB(0.01 mmol·L-1)较RBFL早30 min加入。孵育结束后，所有组别的灌流液均换成正常葡萄糖浓度的K-H液。

1.7 Ach和SNP诱导的高糖孵育大鼠胸主动脉舒张实验

待血管环稳定后，分别按照1.4和1.5的方法检测各组大鼠胸主动脉对Ach和SNP诱导的内皮依赖性舒张反应。

1.8 高糖孵育大鼠胸主动脉SOD及tNOS活性检测

大鼠胸主动脉在不同K-H液中孵育4 h后，将其匀浆，3 000 r·min-1、4℃离心15 min，取上清液备用。按试剂盒操作说明检测正常葡葡糖对照组、HG组和RBFL处理组大鼠胸主动脉SOD和NOS活性。

1.9 统计学分析

采用SPSS 13.0 软件包进行统计学处理。各组大鼠血糖、体质量，血清ROS、NO水平，tNOS、SOD、GSH-Px活性，胸主动脉SOD、NOS活性和Ach、SNP诱导的血管舒张率，均以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果 2.1 各组大鼠一般状况

正常对照组大鼠一般情况良好，活动自如，精神状态佳，毛发光泽顺滑；模型组大鼠一般情况较差，出现多食、多饮和多尿现象，体质量下降，行动迟缓，毛发杂乱无光；RBFL干预组大鼠较模型组大鼠一般情况明显改善。

2.2 各组大鼠血糖和体质量

与正常对照组比较，8周后模型组大鼠体质量明显下降，血糖明显升高(P<0.01)；与模型组比较，RBFL干预组大鼠体质量明显升高，血糖降低(P<0.05或P<0.01)。见表 1。

表 1 给药8周后各组大鼠血糖水平和体质量 Tab.1 Body weights and FBG levels of rats 8 weeks after administration in various groups
x±s
Group n Body weight ( m/g) FBG [ c B/(mmol·L-1)]
* P<0.01 vs control group; △ P<0.05, △△ P<0.01 vs model group.
Control 8 396.74±26.23 5.76±0.45
Model 8 231.36±19.65* 25.37±3.26*
RBFL
Low 6 285.62±19.41△ 18.21±2.31△
Moderate 7 331.45±18.12△△ 15.89±2.12△△
High 7 352.23±19.35△△ 13.12±1.86△△
表选项
2.3 血管张力测定法检测Ach诱导的DM大鼠血管舒张率

与正常对照组比较，模型组大鼠胸主动脉对Ach诱导的内皮依赖性舒张反应即血管舒张率明显降低(P<0.05或P<0.01)；灌胃给药8周后，不同剂量(45、90和180 mg·kg-1)RBFL干预组DM大鼠胸主动脉的内皮依赖性舒张功能显著改善，血管舒张率随着给药剂量的增加而升高(P<0.05或P<0.01)。见图 1。

n=6,x±s； *P<0.05,**P<0.01vs control group;△P<0.05，△△P<0.01vs model group. 图 1 血管张力测定法检测Ach诱导的DM大鼠血管舒张率 Fig.1 Vessel relaxant rates induced by Ach in DM rats detected with vessel tension assay
图选项
2.4 血管张力测定法检测L-NAME或MB预处理及SNP诱导的DM大鼠血管舒张率

分别与模型+L-NAME组和模型+MB组比较，模型+L-NAME+高剂量RBFL干预组和模型+MB+高剂量RBFL干预组大鼠Ach诱导的内皮依赖性舒张率差异均无统计学意义(P>0.05)，见图 2。与模型组比较，给药8周后不同剂量 (45、90和180 mg·kg-1) RBFL干预组大鼠SNP诱导的血管舒张率差异无统计学意义(P>0.05)，见图 3。

n=6,x±s； *P<0.05,**P<0.01vs control group;△P<0.01 vs model group. 图 2 血管张力测定法检测L-NAME(A)或MB(B)预处理后Ach诱导的DM大鼠血管舒张率 Fig.2 Vessel relaxant rates induced by Ach pretreated with L-NAME(A) or MB(B) in DM rats detected with vessel tension assay
图选项
图 3 血管张力测定法检测SNP诱导的DM大鼠血管舒张率 Fig.3 Vessel relaxant rates induced by SNP in DM rats detected with vessel tension assay
图选项
2.5 各组大鼠血清生化指标

与正常对照组比较，DM模型组大鼠血清ROS水平明显增高(P<0.01)，NO水平明显降低(P<0.01)，SOD和NOS活性明显降低(P<0.01)；与模型组比较，灌胃给药8周后，高剂量(180 mg·kg-1) RBFL干预组大鼠ROS水平明显降低(P<0.01)，NO水平升高(P<0.05)，SOD和tNOS活性增强(P<0.01)。不同组别大鼠血清GSH-Px活性比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表 2。

表 2 各组大鼠血清生化指标 Tab.2 Biochemical indexes in serum of rats in various groups
(x±s)
Group n ROS [ λ B/ (U·mL -1)] NO [ c B/ (μmol·L -1)] tNOS [ λ B/ (U·L -1)] SOD [ λ B/ (U·mL -1)] GSH-Px [ λ B/ (U·mL -1)]
*P<0.01 vs control group;△P<0.05,△△P<0.01 vs model group.
Control 8 576.25±57.42 32.65±4.86 19.42±2.31 186.32±12.25 475.35±26.37
Model 8 985.23±46.21 * 20.36±3.57 * 11.57±1.65 * 117.68±13.57 * 469.26±22.31
High RBFL 7 656.42±51.56 △△ 27.54±4.25 △ 17.85±2.21 △ 165.46±15.12 △△ 471.84±24.62
表选项
2.6 血管张力测定法检测Ach诱导的高糖孵育大鼠胸主动脉的血管舒张率

与正常葡萄糖对照组比较，HG组大鼠胸主动脉Ach诱导的血管舒张率明显降低(P<0.01)；与HG组比较，不同剂量 (0.2、0.4和0.8 mg·L-1) RBFL处理组高糖孵育大鼠胸主动脉的血管舒张率明显升高(P<0.05或P<0.01)。见图 4。

n=6,x±s;*P<0.01 vs normal group; △P<0.05，△△P<0.01 vs HG group. 图 4 血管张力测定法检测Ach诱导的高糖孵育大鼠血管舒张率 Fig.4 Vessel relaxant rates induced by Ach after incubation in high glucose K-H solution detected with vessel tension assay
图选项
2.7 血管张力测定法检测L-NAME或MB预处理及SNP诱导的高糖孵育大鼠血管舒张率

分别与HG+L-NAME组和HG+MB组比较，HG+L-NAME+RBFL组和HG +MB+RBFL组大鼠Ach诱导的血管舒张率差异均无统计学意义(P>0.05)。与HG组比较，不同剂量 (0.2、0.4和0.8 mg·L-1) RBFL处理组大鼠SNP诱导的血管舒张率差异无统计学意义(P>0.05)。见图 5和6。

n=6,x±s;*P<0.01 vs normal group;△P<0.01vs HG group. 图 5 血管张力测定法检测L-NAME(A)或MB(B)预处理后Ach诱导的高糖孵育大鼠血管舒张率 Fig.5 Vessel relaxant rates induced by Ach pretreated with L-NAME(A) or MB (B) after incubation in high glucose solution detected with vessel tension assay
图选项
图 6 血管张力测定法检测SNP诱导的高糖孵育大鼠血管舒张率 Fig.6 Vessel relaxant rates induced by SNP after incubation in high glucose K-H solution detected with vessel tension assay
图选项
2.8 各组大鼠胸主动脉SOD及tNOS活性

与正常葡萄糖对照组比较， HG组大鼠胸主动脉组织中SOD和tNOS活性明显下降(P<0.01)；与HG组比较，高剂量 (0.8 mg·L-1)RBFL处理组大鼠胸主动脉组织中SOD和tNOS活性明显升高(P<0.05或P<0.01)。见表 3。

表 3 各组大鼠胸主动脉组织中SOD及tNOS活性 Tab.3 Activities of SOD and tNOS in thoracic aortas tissue of rats in various groups
(n=6,x±s)
GroupSOD [λB/ (U·mL-1)]tNOS[λB/ (U·L-1)]
*P<0.01 vs normal group;△P<0.05,△△P<0.01 vs HG group.
Normal212.36±31.2122.34±2.32
HG136.29±26.37*12.65±1.95*
High RBFL187.65±22.54△△18.36±2.24△
表选项
3 讨 论

DM患者早期就已出现血管内皮功能紊乱。血管内皮细胞贴附于血管内壁，在调节血管张力、血管生成、血小板功能方面具有重要作用，是大部分心血管疾病危险因子作用的重要靶点[8, 9]。氧化应激在DM大血管及微血管并发症的发生中起关键作用，并且其造成血管损伤的早期表现就是进行性内皮功能障碍[10]，因此如何防治DM内皮功能障碍，延缓心血管并发症的发生是治疗DM、提高DM患者生存质量的关键。本研究采用STZ诱导的DM大鼠模型和离体高浓度葡萄糖胸主动脉急性损伤动物模型作为研究对象，观察RBFL慢性整体给药和急性给药对高糖 刺激胸主动脉舒张功能的影响并探讨其可能机制，结果显示：DM模型组和离体高浓度葡萄糖急性损伤组大鼠胸主动脉对Ach诱导的内皮依赖性舒张功能明显下降而对SNP 诱导的舒张作用无明显下降，提示DM初期和急性高糖刺激使主动脉舒张功能受损，且此改变可能与血管平滑肌无关而主要与血管内皮受损有 关；RBFL灌胃给药8周或预处理可以剂量依赖性改善DM和急性高糖刺激大鼠胸主动脉对Ach诱导的内皮依赖性舒张功能，但对SNP诱导的血管舒张反应影响不大，提示RBFL改善胸主动脉的舒张功能主要与保护内皮有关， 而不直接作用于血管平滑肌；RBFL灌胃给药8周还可以明显降低DM大鼠血糖，改善DM大鼠的消瘦状态，奠定了RBFL用于糖尿病治疗的理论基础。

高糖刺激可以抑制血管内源性NO合成而导致血管内皮依赖性舒张功能受损[11]。本研究显示：RBFL改善高糖刺激血管舒张功能可被NOS抑制剂L-NAME和鸟苷酸环化酶抑制剂MB所取消，提示RBFL的血管保护作用可能与增加NO的合成有关。高血糖引起的ROS的大量生成[12]以及体内抗氧化酶活性的降低[13]也是导致血管内皮功能障碍的重要原因。过表达SOD[14]或抑制与ROS生成相关的NADPH氧化酶[15]可以改善高糖引起的血管内皮功能障碍，说明ROS参与了高糖引起的血管内皮功能损伤。本研究结果显示：DM大鼠血清中ROS生成增加，SOD活性下降，tNOS活性和NO水平明显降低；高浓度葡萄糖损伤胸主动脉中SOD和tNOS活性下降，RBFL可以明显抑制DM大鼠血清ROS的过量生成，升高NO水平并增强了DM大鼠血清和高浓度葡萄糖损伤胸主动脉SOD和tNOS活性，提示RBFL可通过提高机体抗氧化酶活性，降低ROS生成以及增加NO合成，改善高糖刺激胸主动脉的内皮依赖性舒张功能。本研究亦观察到各组大鼠血清GSH-Px活性比较无明显差异。GSH-Px的主要作用是降低H2O2水平，DM大鼠体内产生了大量的H2O2，使H2O2在机体大量堆积，可能是DM大鼠GSH-Px水平没有无降低的原因；由于抗氧化酶之间存在着某种互补机制，RBFL (180 mg·kg-1)未改变GSH-Px活性，原因是CAT与GSH-Px有协同清除H2O2的作用，可能由于RBFL对CAT活性影响不明显，故GSH-Px活性亦未改变。

本实验从整体和器官2个角度证实了RBFL可以改善高糖刺激胸主动脉的内皮依赖性舒张功能，该作用可能与减轻血管氧化应激以及促进血管内皮细胞合成NO有关。本研究为RBFL在临床控制DM心血管并发症提供了新的思路和实验依据。

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