B7-H4分子自发现以来一直被公认为是一种T细胞活化强有力的负性调控因子^[1]。在机体的免疫应答过程中,B7-H4分子为免疫细胞的激活提供了刺激信号。活化的T细胞^{[2, 3, 4, 5, 6, 7, 8]}产生以白细胞介素4(IL-4)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和γ干扰素(IFN-γ)为主的细胞因子,其中IL-4、TNF-α和IFN-γ等细胞因子介导的肝细胞免疫性损伤是病毒性肝炎的重要致病机制。B7-H4能否通过抑制IL-4、TNF-α和IFN-γ等细胞因子产生而减弱肝细胞的免疫性损伤目前尚不清楚。关于可溶性mB7-H4与免疫性肝损伤关系的研究目前国内外尚未见相关报道。本研究采用刀豆蛋白A(Con A)诱导小鼠肝损伤模型^[9]来模拟人的免疫性肝损伤,通过输注原核表达的重组可溶性mB7-H4,观察小鼠接受Con A注射后其肝损伤程度,为病毒性肝炎的防治提供理论依据。

昆明(KM)小鼠,雌雄各半,8~10周龄,体质量(20±2) g,由海南医学院动物中心提供,合格证号:43004700010546。pETmB7-H4载体^[10](广东医学院临床免疫学教研室赠送),可溶性mB7-H4(本室制备),Con A和异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(美国Sigma公司),IL-4和IFN-γ 酶联免疫法(ELISA)试剂盒(美国eBioscience公司),天冬氨酸氨基转移酶(ALT)和丙氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒(上海荣盛生物技术有限公司)。

整个实验过程中小鼠自由饮食,随机分为对照组、 Con A组和mB7-H4蛋白100、200及400 μg组,每组10只。

采用IPTG诱导含pET/mB7-H4的 E.coli BL21(DE3)大量表达。在变性的条件下,通过Ni⁺-NTA亲和层析纯化、获得可溶性mB7-H4蛋白。经过复性以及去除内毒素处理,获得具有生物活性的可溶性mB7-H4蛋白。

在Con A注射前2 h,mB7-H4蛋白100、200和400 μg组每只小鼠分别注射可溶性mB7-H4蛋白50、100和200 μg/1.5 mL,注射Con A建立肝损伤动物模型后8 h再次注射上述量蛋白。肝损伤动物模型的建立方法:将Con A 配成浓度为1 g·L^-1,通过尾静脉注射,剂量为25 mg·kg^-1。注射Con A后24和48 h,各组小鼠摘眼球取血,分离后的血清冻存于-80℃备用。引颈处死小鼠取肝脏,置于10%甲醛溶液固定,采用于组织病理学检测。

参照试剂盒说明书进行检测。血清IL-4和IFN-γ水平测定采用定量ELISA试剂盒,其中IL-4检测灵敏度为4 ng·L^-1,IFN-γ检测灵敏度为15 ng·L^-1。血清ALT和AST水平测定采用全自动生化分析仪,由海南医学院附属医院检验科生化室完成。

各组小鼠肝脏组织切片由海南医学院病理教研室制备,切片厚5 μm,HE染色,光学显微镜下进行组织病理学检测。

采用SPSS19.0统计软件进行统计学分析。使用CurveExpert1.3软件绘制标准曲线。血清ATL、AST、IL-4和IFN-γ水平均以x±s表示,组间比较采用析因设计的方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

注射Con A后,mB7-H4蛋白组小鼠不同时间点(5只/点)血清ALT和AST检测结果见表 1。与对照组比较,Con A组和不同剂量mB7-H4蛋白组小鼠血清ALT和AST水平均明显升高(P<0.05)。随着可溶性mB7-H4蛋白注射剂量的增加,ALT和AST值呈明显降低趋势,与Con A组比较,mB7-H4蛋白200和400 μg组小鼠血清ALT和AST水平明显降低(P<0.05 或P<0.01)。

注射Con A后,mB7-H4蛋白组小鼠不同时间点(5只/点)血清IL-4和IFN-γ测定结果见表 2。与对照组比较,Con A组和不同剂量mB7-H4蛋白组小鼠血清IL-4和IFN-γ水平均明显升高(P<0.05)。随着可溶性mB7-H4蛋白注射剂量的增加,血清IL-4和IFN-γ水平呈明显降低趋势,与Con A组比较,不同剂量 mB7-H4蛋白组小鼠血清IL-4和IFN-γ水平差异均有统计学意义(P<0.01)。

注射Con A 24和48 h后,Con A组和不同剂量mB7-H4蛋白组小鼠肝细胞出现不同程度的变性改变,肝窦内可见红细胞淤积。Con A组小鼠肝中央静脉和门静脉区见多叶核粒细胞伴有胞核破损、胞浆出现囊性或空泡样改变以及大量淋巴细胞浸润;mB7-H4蛋白组小鼠肝细胞的损伤较轻,肝脏内未见坏死区,汇管区仅见少量细胞浆出现了空泡样改变,但胞核完整以及少量淋巴细胞浸润。见图 1和2(插页二)。

A:Con A group;B-D:100,200, and 400 μg mB7-H4 group. 图1 Con A注射24 h后各组小鼠肝脏组织病理学(HE,×100) Fig.1 Pathology of liver tissue of mice in various groups 24 h after Con A injection(HE,×100)

图选项

A:Con A group;B-D:100,200, and 400 μg mB7-H4 group. 图2 Con A注射48 h后各组小鼠肝脏组织病理学(HE,×100) Fig.2 Pathology of liver tissue of mice in various groups 48 h after Con A injection(HE,×100)

图选项

目前对B7-H4的研究主要集中在肿瘤方面^{[11, 12, 13, 14]},如卵巢癌和胃癌等,B7-H4在这些癌组织中均高表达。B7-H4在炎症方面的研究较少,主要集中于类风湿关节炎^[15]和肾病^[16]等自身免疫性疾病,而关于其在自身免疫性肝炎中的表达情况尚未有相关研究。本研究以 Con A诱导的小鼠肝损伤^[17]为研究对象,很好地模拟了人类病毒性肝炎和自身免疫性肝病等疾病,当给予Con A 剂量为20 mg·kg^-1,2 h后肉眼可见肝脏淤血变暗,并逐渐加重,24 h 后可见肝脏几乎完全水肿坏死;光镜下观察可见肝内大量淋巴细胞浸润,在汇管区尤为明显,肝窦内红细胞淤积等。本研究结果显示:在注射Con A后,Con A组和mB7-H4蛋白组小鼠血清中ALT和AST水平较对照组均明显升高,随着可溶性mB7-H4蛋白注射剂量的增加,ALT和AST呈降低趋势,均低于Con A组;各组小鼠肝组织切片后经HE染色,在光学显微镜下可见:mB7-H4蛋白组小鼠肝脏损伤均Con A组均有不同程度的减轻。本研究结果表明:可溶性mB7-H4蛋白在Con A诱导小鼠肝损伤中,能减轻Con A带来的损伤,具有肝脏保护作用。

Con A 诱导的肝炎模型中,Con A 注射后,血清IL-4 和IL-5 水平升高,IL-4 和IL-5主要由NKT 细胞分泌产生,这可能是其导致肝脏损伤的一个重要原因;在IL-4和IL-5 基因敲除的小鼠或用其单抗预处理,均不能导致Con A诱导肝损伤,说明IL-4和IL-5 在Con A 诱导的肝炎模型中也起到非常重要的作用。本研究结果显示:注射Con A后,各组小鼠血清IL-4和IFN-γ水平较对照组均明显升高,且随着可溶性mB7-H4蛋白注射剂量的加大,IL-4和IFN-γ水平呈减低趋势,明显低于Con A组。这与文献^[18]报道一致,TNF-α和IFN-γ是该模型肝脏损伤中最重要的细胞因子,IL-4和IL-5在Con A诱导的肝炎模型中也发挥了重要的作用^[19]。

本课题组采用小鼠尾静脉注射可溶性mB7-H4蛋白方法,实现了最佳可溶性mB7-H4蛋白浓度在自身免疫性肝炎模型中发挥保护的作用^[20]。本研究结果显示:注射重组原核表达可溶性mB7-H4蛋白能明显抑制受Con A刺激的小鼠释放IFN-γ和IL-4,提示可溶性mB7-H4是通过抑制IFN-γ和IL-4分泌,从而下调免疫炎症反应,保护肝细胞。本研究扩展了B7-H4对免疫炎症反应调节功能的认识,为可溶性mB7-H4在病毒性肝炎防治研究中的应用提供了实验依据。但有关可溶性mB7-H4在免疫性肝损伤中的作用机制尚有待进一步研究。