吉林大学学报(医学版)  2016, Vol. 42 Issue (01): 31-35

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张宝月, 张俊农
ZHANG Baoyue, ZHANG Junnong
表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂厄洛替尼联合山奈酚诱导卵巢癌细胞凋亡的协同机制
Synergetic effect of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor kaempferol in combination with tarceva on apoptosis of ovarian cancer cells
吉林大学学报(医学版), 2016, 42(01): 31-35
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2016, 42(01): 31-35
10.13481/j.1671-587x.20160107

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收稿日期: 2015-06-04
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张宝月, 张俊农. 表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂厄洛替尼联合山奈酚诱导卵巢癌细胞凋亡的协同机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(01): 31-35.
ZHANG Baoyue, ZHANG Junnong. Synergetic effect of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor kaempferol in combination with tarceva on apoptosis of ovarian cancer cells[J]. Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2016, 42(01): 31-35.
表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂厄洛替尼联合山奈酚诱导卵巢癌细胞凋亡的协同机制
张宝月1, 张俊农2     
1. 海洋石油总医院妇科, 天津 300452;
2. 天津医科大学附属第二医院妇科, 天津 300211
收稿日期: 2015-06-04
基金项目: 国家医学教育发展中心基金资助课题(2011-29-08-011)
作者简介: 张宝月(1978-),女,天津市人,主治医师,医学硕士,主要从事妇科肿瘤方面的研究。
通信作者: 张俊农,副主任医师,硕士研究生导师(Tel:022-25809458,E-mail:zhangjnhome@163.com)
摘要: 目的: 探讨厄洛替尼和山奈酚对表皮生长因子受体酪氨酸激酶(EGFR-TPK)的抑制作用,并阐明二者对卵巢癌细胞生长的协同抑制作用机制。 方法: 培养人卵巢癌SKOV-3细胞,将细胞分为空白组、山奈酚组和厄洛替尼组,将不同浓度山奈酚与厄洛替尼加入到EGFR-TPK和人卵巢癌SKOV-3细胞中, ELISA法检测EGFR-TPK的活性,采用Transwell小室法检测各组SKOV-3细胞侵袭转移能力,采用酶标仪检测各组SKOV-3细胞凋亡蛋白caspase-3活性,MTT法检测各组SKOV-3细胞的生长抑制率及山奈酚联合厄洛替尼对SKOV-3细胞的生长抑制作用。 结果: 山奈酚和厄洛替尼对EGFR-TPK的半数抑制浓度(IC50)分别为(2.33±0.32)g·L-1和(1.75±0.18)g·L-1,二者比较差异无统计学意义(P>0.05)。与空白组比较,山奈酚和厄洛替尼组穿膜细胞数减少(P<0.05或 P<0.01),SKOV-3细胞中凋亡蛋白 caspase-3活性明显增加(P<0.05或 P<0.01)。随着山奈酚和厄洛替尼浓度增加,SKOV-3细胞生长抑制率不断增加,与空白组比较差异均有统计学意义(P<0.05或 P<0.01)。 结论: 山奈酚联合厄洛替尼对人卵巢癌SKOV-3细胞具有协同抑制作用,并对SKOV-3细胞转移起到抑制作用。
关键词: 山奈酚    厄洛替尼    表皮生长因子受体酪氨酸激酶    SKOV-3人卵巢癌细胞株    抑制作用    细胞凋亡    caspase-3    
Synergetic effect of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor kaempferol in combination with tarceva on apoptosis of ovarian cancer cells
ZHANG Baoyue1, ZHANG Junnong2     
1. Department of Gynecology, General Hospital, Marine Oil, Tianjin300452, China;
2. Department of Gynecology, Second Hospital, Tianjin Medical University, Tianjin 300211, China
Abstract: Objective: To study the inhibitory effect of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase(EGFR-TPK),and to clarify the mechanism of their synergetic inhibitory effects on the growth of ovarian cancer cells. Methods: The human ovarian cancer SKOV 3 cells were cultured and divided into blank group,kaempferol group and tarceva group. The activities of EGFR-TPK were detected by ELISA method.The invasion abilities of SKOV-3 cell lines were determined by Transwell assay. The caspase-3 activities of SKOV-3 cells were measured. The inhibitory rates of growth of SKOV-3 cells were determined using MTT method. Results: The half inhibitory concentrations (IC50)of kaempferol and tarceva were (52.33±0.32)g·L-1and (1.75±0.18)g·L-1,there was no significant differences between them(P>0.05).The inhibitory rates of growth of SKOV-3 cells were increased with the increasing of doses of kaempferol and tarceva,and there were significant differences compared with blank group(P<0.05 or P<0.01). The caspase-3 activities of SKOV-3 cells of in kaempferol and tarceva groups were significantly increased compared with blank group(P<0.05). Conclusion: Kaempferol in combination with tarceva has a synergetic effect on the growth of ovarian cancer SKOV-3 cells.
Key words: kaempferol    tarceva    epidermal growth factor receptor tyrosine kinase    ovarian cancer SKOV-3 cells    inhibitory effect    apoptosis    caspase-3    

卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤之一,在全世界范围内,其病死率位居妇科恶性肿瘤的第5位[1]。由于其位于盆腔,早期患者并无明显症状,发病时很多已达晚期,尽管经过治疗后大多数患者可获得缓解,但仍有70%的患者会出现病情复发[2, 3]。目前化疗在卵巢癌的治疗中占有重要地位,但其疗效仍然不理想,因此寻找一种有效的药物来抑制卵巢癌至关重要。目前分子靶向药物的研究主要集中在表皮生长因子受体酪氨酸蛋白激酶(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase,EGFR-TPK)上,其在多种恶性肿瘤组织中均存在过表达[4]。有研究[5, 6, 7] 表明:EGFR-TPK抑制剂厄洛替尼(特罗凯)是一种靶向竞争性抑制剂,对多种肿瘤细胞均具有生长的抑制作用,但是会对患者的正常细胞产生毒害作用。目前天然无毒副作用的活性成分对EGFR-TPK抑制作用的研究被广泛关注,但山奈酚联合厄洛替尼在治疗卵巢癌中的研究却未见报道。本实验拟以人卵巢癌SKOV-3细胞为研究对象,通过体外细胞实验初步探讨天然活性成分山奈酚联合厄洛替尼在治疗卵巢癌的价值,以期最大限度地降低药物的毒性,提高药效和安全性。

1 材料与方法 1.1 实验细胞、主要试剂和仪器

人卵巢癌SKOV-3细胞株购自中国科学院典型培养物种保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心(ATCC),在本实验室进行培养。山奈酚(分析标准品,20 mg,从姜根茎提取)购自阿拉丁试剂(上海)有限公司,批号:K107144,其标准储备溶液用一定浓度的乙醇溶液进行配制,其浓度为100 μmol·L-1;高浓度的乙醇溶剂会对蛋白的结构和功能有一定的影响,本实验乙醇用量控制在3.0%以内,不会对EGFR-TPK和人卵巢癌SKOV-3细胞产生影响。特罗凯(盐酸厄洛替尼片,瑞士罗氏有限公司,国药准字J20090116),浓度为15 g·L-1,给药前超声处理1 h。caspase-GlooR3检测试剂盒购自Sigma-aldrich(上海)贸易有限公司,RPMI1640 培养基购自赛默飞世尔生物化学 (北京)有限公司,优级肽牛 /小牛血清购自澳大利亚 PAA 公司,胰蛋白酶购自美国 Gibco公司,二甲基亚砜(DMSO)购自广州瑞舒生物科技有限公司,四甲基偶氮唑盐(MTT,5 ×103 mg·L-1,PBS配制)购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。酶标仪(型号:SpectraMax Plus384)购自美谷分子仪器(上海)有限公司,生物安全柜(型号: HR40-ⅡA2 Haier)购自青岛海尔有限责任公司,pHS-3C型酸度计购自上海雷磁仪器厂,EPS-300电泳仪及电泳设备购自上海天能有限公司,Bio-Rad680型酶联检测仪购自珀金埃尔默仪器(上海)有限公司。

1.2 EGFR-TPK活性检测

SKOV-3细胞用低渗酶提取缓冲液4℃提取,超声破碎细胞,离心,收集上清液,进行分装,-80℃保存,参照蒋超等[8]方法,将药物分别加入到用 PBS 洗过的 96 孔培养板中,每孔 10 μL,每浓度 3 孔。反应体系:70 μL 的 RT buffer,20 μL含EGFR-TPK的PBS溶液,使反应系统总体积为100 μL,在37℃水浴1 h后,用洗液(50 mmol·L-1 Tris-HCl,pH 7.5,0.15 mol·L-1 NaCl,0.05 mmol·L-1 MgCl2,0.02% Tween20)清洗3次,除去未结合的游离底物,再每孔加入1% BSA100 μL,室温封闭30 min,阻止生物素与链亲和素蛋白的非特异性结合,洗板,每孔加入50 μLSA-ALP稀释液(100 μg·L-1),37℃水浴 1 h,洗板,每孔加入10 μL不同浓度的山奈酚和50 μL邻苯二胺(OPD)(1 g·L-1,pH9.5),37℃水浴30 min;每孔加入0.5 mg·L-1的NaOH终止反应。酶标仪测定波长490 nm处吸光度(A)值,以确定EGFR-TPK的活性,同时设置不加药物的空白组和厄洛替尼组。酶的抑制率(％)＝实验孔A值/空白孔A值×100。

1.3 人卵巢癌SKOV-3细胞侵袭转移能力的检测

取对数生长期的SKOV-3细胞,用完全培养液配制成细胞悬液,每孔250 μL,接种于96孔板中,在37℃、5% CO2和饱和湿度的环境下孵化24 h,待细胞完全贴壁生长后分为空白组、厄洛替尼组(0.1、1.0、2.5和5.0 g·L-1)和山奈酚组(0.1、1.0、2.5和5.0 g·L-1),继续培养24 h,采用Transwell小室法构建体外侵袭模型,分别消化不同组的SKOV-3细胞,制成细胞悬液,并加于混合的条件培养基,甲醛固定15 min后,常规HE染色后于400倍光镜下计数膜背面侵袭的细胞数,并计算平均穿膜细胞数[9]。

1.4 人卵巢癌SKOV-3细胞中凋亡蛋白caspase-3活性的检测

细胞分组同上,采用 caspase-GlooR3检测试剂盒进行检测,具体过程参照产品说明书。 分析前将试剂与96孔板置于室温平衡,之后将各组SKOV-3细胞以每孔15 × 104接种于96孔板,选取不同浓度的山奈酚和厄洛替尼处理 24、48和72 h 后,向细胞培养物中加等体积(1∶1)的caspase-Glo试剂,置于震荡仪,以400 r·min-1转速轻轻震荡混合30 s,室温孵育60 min后,用酶标仪检测。

1.5 MTT法检测SKOV-3细胞生长抑制率

将对数生长期的SKOV-3细胞分为空白组、厄洛替尼组(0.1、0.5、1.0、2.5和5.0g·L-1)和山奈酚组(0.1、0.5、1.0、2.5和5.0g·L-1),用0.25%胰蛋白酶消化单细胞,重悬于新鲜生长培养液中;细胞接种于96孔培养板;置于37℃、5% CO2培养箱中培养过夜;根据实验设计,处理96孔板中的细胞,继续置于37℃、5% CO2培养箱中培养,药物处理24、48和72 h时间后,直接于每孔中加入MTT溶液,37℃孵育2~4 h;室温静置至沉淀完全溶解(约10 min),用酶标仪(检测波长570 nm)检测各孔A值,计算平均值。细胞生长抑制率= (空白组A值-抑制剂组A值)/空白组A值×100％。

1.6 山奈酚联合厄洛替尼对SKOV-3细胞生长的抑制作用

根据参文[11]中方法稍作调整后,研究山奈酚联合厄洛替尼对SKOV-3细胞生长抑制作用的影响,Va 代表山奈酚单独应用的抑制率,Vb 代表厄洛替尼单独应用的抑制率,Vab则表示二者联合使用时的抑制率,如果二者联合使用时是独立的,不会相互影响,那么预期的抑制率Vc (Vc=Va × Vb)的值与Vab 是相同的,二者联合使用也只是简单的加和。Vab-Vc<-0.1,两者对SKOV-3细胞生长的抑制作用呈现协同效应;-0.1<Vab-Vc<0.1,两者对酶的抑制作用呈加和效应;Vab-Vc>0.1,两者对SKOV-3细胞生长的抑制作用呈拮抗作用。

1.7 统计学分析

采用SPSS11.0统计软件进行统计学分析。IC50、穿膜细胞数、caspase-3活性和细胞生长抑制率均以x±s表示,组间比较采用析因设计方差分析,两两比较采用最小显著差法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果 2.1 山奈酚和厄洛替尼对EGFR-TPK活性的抑制作用

低浓度(0~1.0 g·L-1)山奈酚对EGFR-TPK活性的抑制作用不明显;随着山奈酚浓度的增加(1.0~4.0 g·L-1),对EGFR-TPK活性的抑制作用明显加强,但当浓度达到4.0 g·L-1后,对其活性的抑制趋于平缓,其半数抑制浓度 (IC50) 为(2.33±0.32)g·L-1,与厄洛替尼的IC50为(1.75±0.18) g·L-1相比非常接近(P>0.05),表明山奈酚对EGFR-TPK的活性有良好的抑制效果。见图 1。

图1 山奈酚和厄洛替尼对EGFR-TPK的抑制作用 Fig.1 Inhibitory effects of kaempferol and tarceva on EGFR-TPK
图选项
2.2 各组SKOV-3细胞的侵袭转移能力

随着山奈酚和厄洛替尼浓度的增加,与空白组比较,山奈酚组和厄洛替尼组SKOV-3细胞穿膜细胞数不断减少(P<0.05或P<0.01),表明二者对人卵巢癌SKOV-3细胞侵袭转移具有一定的抑制作用。见表 1。

表1 各组SKOV-3细胞侵袭能力和caspase-3活性 Tab.1 Invasion abilities and caspase-3 activities of SKOV-3 cells in various groups
(n=6,x±s)
GroupDose(g·L-1)No.of cells penetrating membraneCaspase-3 activity
(t/h) 0244872
*P<0.05,** P<0.01 compared with blank group.
Blank0.048.56±3.1711.78±0.8512.54±0.9014.13±1.0515.54±1.12
Kaempferol0.140.23±2.52*10.58±0.4512.79±1.2314.36±1.5118.65±1.88*
1.030.55±2.52*11.43±1.0121.61±0.98*27.46±1.16*33.22±2.03*
2.521.34±3.31**11.43±0.8730.32±1.86*37.53±3.05**44.09±3.65**
5.012.11±2.12**11.45±0.4239.43±3.01**46.36±3.51**57.36±5.78**
Tarceva0.145.22±1.13*10.98±0.7513.89±0.9617.36±1.0123.06±1.56*
1.033.74±2.02*11.23±1.2125.62±2.71*29.13±2.88*35.66 ±3.85**
2.525.76±1.42**11.62±0.8735.54±2.66**48.33±3.35*52.09±3.65**
5.015.54±1.02**11.25±0.5243.65±2.98**52.36±5.32*61.06±6.65**
表选项
2.3 各组SKOV-3细胞中caspase-3活性

与空白组比较,低剂量(0.1 g·L-1)山奈酚组和厄洛替尼组作用24、48和72 h后caspase-3活性开始增加,而高剂量(1.0、2.5和5.0 g·L-1)山奈酚组和厄洛替尼组SKOV-3细胞中caspase-3活性明显增加(P<0.05或P<0.01)。见表 1。

2.4 各组SKOV-3细胞的生长抑制率

与空白组比较,山奈酚组和厄洛替尼组SKOV-3细胞生长抑制率均升高且差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表 2。

表2 各组SKOV-3细胞的生长抑制率 Tab.2 Inhibitory rates of growth of SKOV-3 cells in various groups
(n=6,x±s,η/%)
GroupDose(g·L-1)Inhibitory rate
(t/h)244872
*P<0.05,** P<0.01 compared with blank group.
Blank0.00.11±0.030.12±0.040.14±0.04
Kaempferol0.13.13±0.31*10.54±2.75*15.18±2.91**
0.511.25±1.77**25.33±3.32**38.34±4.88**
1.032.22±2.17**42.52±3.34**52.64±5.35**
2.547.35±4.22**64.54±6.09**73.47±9.05**
5.061.32±6.41**73.13±8.05** 88.87±8.76**
Tarceva0.121.43±4.01** 39.54±5.75**47.98±6.11**
0.531.55±5.77**55.45±6.32**58.43±4.98**
1.046.23±5.89**65.32±7.32**75.32±4.32**
2.558.11±7.30**71.14±3.51**86.53±5.71**
5.064.23±7.21**79.85±5.01**91.34±9.19**
表选项
2.5 山奈酚联合厄洛替尼对人卵巢癌SKOV-3细胞生长抑制的协同作用

在固定厄洛替尼的浓度时,SKOV-3细胞生长抑制率随着山奈酚浓度的增加而增加;固定山奈酚的浓度后,随着厄洛替尼浓度的增加SKOV-3细胞生长抑制率呈不断增加的趋势。进一步分析可知,当厄洛替尼在低浓度下,山奈酚联合厄洛替尼对SKOV-3细胞生长具有较好的抑制率,而随着厄洛替尼浓度的增加,这种协同效应在不断地减弱,当厄洛替尼浓度达到2.5 g·L-1时,二者对SKOV-3细胞生长的抑制协同效应已经完全消失。见表 3。

表3 山奈酚联合厄洛替尼对人卵巢癌SKOV-3细胞的生长抑制效应 Tab.3 Inhibitory effect of kaempferol combined with tarceva on growth of SKOV-3 cells
Kaempferol(g·L-1)Tarceva (0.5 g·L-1)Tarceva (2.5 g·L-1)Tarceva (5.0 g·L-1)
VabVcVab-VcVabVcVab-VcVabVcVab-Vc
AD:Additive effect;SY: Synergetic effect.
0.50.0350.149-0.114SY0.1170.201-0.084AD0.2840.279 0.005AD
2.50.1130.242-0.129SY0.2150.306-0.091AD0.3140.342-0.028AD
5.00.2350.373-0.138SY0.333.0.395-0.062AD0.4350.425 0.010AD
表选项
3 讨 论

肿瘤侵袭和转移是一个多阶段的复杂过程,这个过程受很多因素影响,EGFR基因的突变和EGFR的异常高表达可以在多种实体恶性肿瘤中检测到[12, 13, 14]。EGFR蛋白的异常高表达促使肿瘤细胞活化,长期处于无限增殖状态,是肿瘤形成的重要原因之一。本研究对山奈酚和厄洛替尼抑制EGFR-TPK能力和抑制SKOV-3细胞生长的能力进行了评估,并对二者的联合用药进行了探讨,结果显示:二者对EGFR-TPK的活性和SKOV-3细胞生长都具有良好的抑制能力,且对SKOV-3细胞生长的抑制活性与体外抑酶实验的趋势相一致,抑制作用都存在浓度依赖性,2种药物对EGFR-TPK的抑制作用,延迟了肿瘤细胞的活化时间,降低了胞基质的降解和新血管的生成速度,进而能够诱导肿瘤细胞穿过人工基底膜的能力下降,很好阻碍了SKOV-3细胞的转移;二者对SKOV-3细胞生长的协同作用结果显示:山奈酚与低浓度厄洛替尼具有很好的协同作用,这为天然活性成分山奈酚的使用提供了良好的理论依据,使其安全用药得以发展和应用。

在细胞凋亡过程中,酶联反应的终末因子是由caspase-3和caspase共同组成的[15]。caspase-3是导致细胞凋亡的关键酶,在实验过程中caspase-3能够催化底物Ac-DEVD-pNA产生黄色的pNA,在波长405 nm附近紫外吸收,因此可以通过测定波长405 nm处A值来检测caspase-3的活性[16]。本实验结果显示:经过山奈酚和厄洛替尼处理后,caspase-3活性不断增加,且呈时间和剂量依赖性,这意味着山奈酚和厄洛替尼还能够对caspase-3活性产生激活作用,进而对酶联反应进行有效的调控;最终对SKOV-3细胞生长起到抑制作用。

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