胸腺上皮细胞(thymic epithelial cells,TECs)是一群不表达泛造血细胞标志CD45而表达上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)标志的胸腺内非胸腺细胞,也是胸腺基质细胞(thymic stromal cells,TSCs)中最重要的细胞型^[1]。TECs有2个重要的亚群 ——皮质TECs(cortical TECs,cTECs)和髓质TECs(medullary TECs,mTECs),其栖居于胸腺的不同部位,有序指导胸腺细胞的发育过程^[2]。尽管TECs功能很重要,但由于成年小鼠胸腺会发生增龄性萎缩,使得功能性TECs被脂肪细胞增龄性替代,并且其本身就不足胸腺中细胞结构的1%,加之缺乏合适的技术来纯化、量化这个稀少而离散的细胞群^[3],导致对成年小鼠TECs的功能以及分化能力的了解有限。目前,已有研究^{[4, 5, 6]}表明:胶原酶和Liberase可以分离胸腺组织中细胞与细胞、细胞与基质间的网络交联,得到TSCs和胸腺细胞的单细胞悬液,随后通过流式细胞术即可识别离散的TECs。另有研究^{[7, 8]}表明:免疫磁珠分选法(magnetic activated cell sorting,MACS)和密度梯度离心法可以通过富集TSCs而间接实现对TECs的富集。本研究首先对比了新型的Liberase^TM与传统的collagenase Ⅴ对成年小鼠胸腺的消化能力(包括消化时间、细胞活力以及TSCs的产量),然后比较了MACS、Percoll与Ficoll 3种富集方法对成年小鼠TECs的富集效果,旨在探寻高效且具有准确体内代表性的TECs分离、富集方法,为后续Real-time PCR和分子谱系分析等实验提供高纯度的TECs。

27只SPF级BABL/c小鼠,6~8周龄,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物许可证号:CCXK(京)-2012-0001,在吉林大学第一医院转化医学研究院实验动物中心无菌饲养。混合胶原酶Liberase^TM购自德国罗氏公司,collagenase Ⅴ、DNaseⅠ和Ficoll淋巴细胞分离液购自德国Sigma公司,新生牛血清和DMEM培养基购自美国Gibco公司,小鼠anti-CD45-APC-Cy7、anti-CD45-APC、anti-EpCAM-FITC、anti-I-A/I-E-PerCP、anti-Ly51-AF647、anti-CD4-FITC、anti-CD4-AF647及PI抗体购自美国Biolegend公司,MACS anti-APC-MicroBeads 购自美国BD公司,MACS LD柱购自德国Miltenyi公司,Percoll分层液(ρ=1.130 g·mL^-1)购自北京索莱宝公司。MACS分选器购自德国Miltenyi公司,FACS Canto型流式细胞仪购自美国BD公司。

由于单个成年小鼠胸腺中TECs含量较为稀少,所以实验采用汇集胸腺法(pooled thymus)提取TECs,每个实验组汇集3只小鼠胸腺。实验分为TECs的分离实验与富集实验。分离实验根据酶的种类与工作浓度分为5个分离组:1.0 g·L^-1collagenase Ⅴ组和0.5、0.7、1.0及2.0 U·mL^-1Liberase ^TM组。采用分离实验得出的最适酶分离浓度(Liberase ^TM 1.0 U·mL^-1)进行TECs的分离与富集。富集实验分为4组:未进行富集处理的对照组和MACS、Percoll及Ficoll富集组。

小鼠经脱颈处死后,浸入75%酒精消毒1 min,沿着胸骨边缘剪断两侧肋骨,上掀胸骨,取出胸腺。在PBS缓冲液中先剔除血管及结缔组织,随后将胸腺剪成小块,用注射器背部轻轻挤压组织,允许胸腺细胞释放,反复更新PBS、挤压胸腺直至溶液变澄清。

将处理过的组织剪成小于1 mm×1 mm×1 mm小块放入15 mL离心管中,加入新鲜配制的3 mL 消化酶(Liberase^TM或collagenase Ⅴ)工作液,45°角置于37℃振荡水浴中温和作用15 min,随后通过40 μm细胞过滤网将上清液过滤到冰上的终止液中(含10%新生牛血清的DMEM培养基)终止消化过程,再向残余组织中加入3 mL 消化酶工作液,37℃水浴继续震荡作用15 min,再将上清液过滤到终止液中,如若仍有组织残余,重复消化过程,直至组织消化完全,全过程一般不超过60 min。将含消化细胞的终止液500 g、4℃离心10 min,弃上清,加入适量的FACS缓冲液(10 mL 10% 叠氮钠和1 g 牛血清白蛋白于1 L D-Hank’s 溶液中)重悬,即为消化物,待用。

1.0 g·L^-1collagenase Ⅴ组和0.5、0.7、1.0及2.0 U·mL^-1Liberase ^TM组分别按照相应的酶工作浓度对胸腺组织进行消化,方法同1.4,记录消化时间,得到的消化物经细胞计数后,直接用于流式抗体染色。

①Percoll富集法:参考Stoeckle等^[8]的实验方法,并采用1.5中得到的最适酶消化浓度(Liberase ^TM 1.0 U·mL^-1)对汇集胸腺进行消化;于所得消化物中加入2 mL Percoll工作液(2.96 mL未稀释Percoll溶液和0.6 mL 1.5 mol·L^-1 的氯化钠于2.44 mL 蒸馏水中,终密度ρ=1.07 g·mL^-1),充分混匀后,沿着管壁缓慢加入10 mL DMEM培养基,避免2种液体相混,3500 g、升速降速调为0、4℃离心35 min。离心后小心收集白膜层(即低密度层细胞),加入10 mL DMEM,300 g、4℃离心10 min,弃上清,加入适量FACS缓冲液,细胞计数,随后进行流式抗体染色。②MACS富集法:由于CD45是胸腺细胞的泛表达标志,参考Seach等^[9]的方法,采用anti-CD45-APC抗体与anti-APC MicroBeads 结合的两步MACS法,清除大量的CD45⁺ 胸腺细胞,富集TSCs。首先,按照1.5中得到的最适酶消化浓度(Liberase^TM 1.0 U·mL^-1)对汇集胸腺进行消化,并对消化物进行计数;按每1×10⁷个细胞加入100 μL MACS缓冲液(含0.5%牛血清白蛋白和2 mmol·L^-1EDTA的PBS溶液)和10 μL anti-CD45-APC抗体,混匀后4℃避光孵育10 min。加入孵育体系10倍体积的MACS缓冲液,300 g、4℃离心10 min。弃上清,按每1×10⁷个细胞加入80 μL MACS缓冲液重悬细胞后,再按每1×10⁷个细胞加入20 μL anti-APC MicroBeads,混匀,4℃,避光15 min。加入孵育体系10倍体积的MACS缓冲液,洗去未结合的抗体,300 g、4℃离心10 min。按每1×10⁸个细胞加入500 μL MACS缓冲液等待磁珠分选。根据所得的细胞数及收集物为CD45-TSCs等情况,选择LD柱(最多容纳5 × 10⁸个细胞)。经过润洗柱子、细胞上样和洗柱3个过程后,得到纯化的TSCs,细胞计数后,等待流式抗体染色。③Ficoll富集法:参考Scoville等^[10]的方法,并按照1.5中得到的最适酶消化浓度(Liberase^TM 1.0 U·mL^-1)对汇集胸腺进行消化,消化物用5 mL DMEM培养基重悬;随后,将重悬液沿管壁缓慢加到2.5 mL Ficoll分离液的上层,避免2种液体相混,400 g,升速降速调为0,室温离心20 min。离心后小心收集白膜层,加入9 mL DMEM,2000 r·min^-1、4℃离心5 min,弃上清,加入适量FACS缓冲液,细胞计数后,进行流式抗体染色。

以各组待测的样品细胞,按每1×10⁶个细胞加入10 μL anti-CD45-APC-Cy7(或anti-CD45-APC)和10 μL anti-EpCAM-FITC抗体,而富集实验中对照组与Percoll组的样品细胞还需加入10 μL anti-I-A/I-E-PerCP和10 μL anti-Ly51-AF647抗体,混匀,4℃避光作用30 min。加入1 mL FACS缓冲液,1650 r·min^-1、4℃离心5 min,洗去未结合抗体。弃上清,加入300 μL FACS缓冲液重悬等待流式细胞仪检测(PI抗体于流式细胞仪上机前加入)。对于分离实验,流式细胞术主要检测各分离组所得的单细胞悬液中细胞活力(PI^-)以及TSCs(CD45^-)比例(即TSCs产量)。对于富集实验,主要检测富集后各组的细胞活力、TSCs比例以及TSCs中TECs(EpCAM⁺)比例。对照组与Percoll组进行cTECs(Ly51⁺ MHCⅡ⁺)和mTECs(Ly51^- MHCⅡ⁺)比例的检测。

采用SPSS17.0软件进行统计学分析。分离实验中消化时间、细胞活力、TSCs产量和富集实验中细胞活力、TSCs及TECs比例均以x±s表示,多组间样本均数比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK-q检验,以α= 0.05为检验水准。

①消化时间:4个Liberase^TM分离组所用的消化时间明显少于 1.0 g·L^-1collagenase Ⅴ组(P<0.05或P<0.01);在4个Liberase ^TM分离组中,1.0 U·mL^-1Liberase^TM组的消化时间明显少于 0.5 U·mL^-1Liberase^TM组(P<0.05),而与 0.7和2.0 U·mL^-1Liberase^TM组比较差异无统计学意义(P>0.05)。②细胞活力:4个Liberase^TM分离组的细胞活力均较高,但组间比较差异无统计学意义(P>0.05),但其均明显高于1.0 g·L^-1collagenase Ⅴ 组(P<0.01)。3③TSCs的产量: 1.0 g·L^-1collagenase Ⅴ组与1.0和 2.0 U·mL^-1Liberase^TM组中TSCs的产量比较差异无统计学意义(P>0.05),但上述3组TSCs的产量均明显高于 0.5和0.7 U·mL^-1Liberase^TM组(P<0.05或P<0.01)。见图 1和表 1。

A,B: 1.0 g·L-1 collagenase Ⅴ group;C,D: 0.5 U·mL-1LiberaseTM group;E,F: 0.7 U·mL-1LiberaseTM group;G,H: 1.0 U·mL-1LiberaseTM group;I,J: 2.0 U·mL-1LiberaseTM group;A,C,E,G, I: Cell viability (percentage of live cells);B,D,F,H,J: Yield of TSCs (percentage of TSCs in live cells). 图1 流式细胞术检测5个分离组细胞产生TSCs的能力 Fig.1 Abilities of TSCs production in five isolation groups detected by FACS

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Percoll、MACS、Ficoll富集组和对照组的细胞活力均较高,且组间比较差异均无统计学意义(P>0.05),说明3种富集方法对细胞的破坏均较小。与对照组比较,MACS和Percoll富集组中TSCs比例明显增加(P<0.01),但Ficoll富集组中TSCs比例明显降低(P<0.01)。MACS富集组TSCs比例明显高于Percoll富集组(P<0.01)。

Percoll和Ficoll富集组TSCs中TECs比例均高于对照组和MACS组(P<0.01)。根据活细胞中TSCs比例及其TECs的比例可知活细胞中TECs所占的比例(即富集效果)。与对照组比较,3个富集组活细胞中TECs比例均明显增加(P<0.05或 P<0.01),其中Percoll组TECs比例明显高于MACS和Ficoll组(P<0.01)。见图 2和表 2。

A-C: Control group;D-F: Percoll enrichment group;G-I: MACS enrichment group;J-L: Ficoll enrichment group;A,D,G,J: Cell viability (percentage of live cells);B,E,H,K: Percentage of TSCs in live cells;C,F,I,L: Percentage of TECs (EpCAM+ cells) in TSCs. 图2 流式细胞术检测3种TECs富集方法效果 Fig.2 Effects of three TECs enrichment methods detected by FACS

图选项

进一步分析Percoll富集组TECs 2个亚群cTECs和mTECs的表达情况,Percoll富集组中cTECs的比例约为(35.70±1.21)%,与对照组[(28.07±7.47)%]比较差异无统计学意义(P>0.05)。同样,Percoll富集组和对照组中mTECs的比例分别为(54.93±3.26)%和(43.03±13.58)%,组间比较差异也无统计学意义(P>0.05)。此外,对照组和Percoll富集组中cTEC/mTEC的百分比分别为(70.33±10.73)%和(65.33±3.18)%,组间比较差异无统计学意义(P>0.05),说明Percoll富集后并未对TECs亚群细胞的比例产生影响。见图 3。

A: Percentage of mTECs (Ly51- MHCⅡ+) and cTECs (Ly51+ MHCⅡ+) from TEC population in control group; B: Percentage of mTECs and cTECs from TEC population in Percoll enrichment group. 图3 流式细胞术检测Percoll富集组和对照组中cTECs和mTECs的百分比 Fig.3 Percentages of cTECs and mTECs in control and Percoll enrichment groups detected by FACS

图选项

与其他上皮细胞不同,TECs以独特的三维网状结构的形式存在,能够极大限度地允许胸腺细胞在其内发生迁移和细胞作用^[11],对胸腺细胞的发育以及自身免疫耐受的诱导都起着尤为重要的作用。而TECs构成的胸腺微环境是异源的,使得组织学的方法无法准确定量出TECs的多样性^[3]。1982年,Kyewski等^[12]开创了用酶消化胸腺组织的方法,首次得到了TSCs和胸腺细胞的混合物。2002年,Gray等^[13]通过利用泛造血标志CD45,准确定义出TSC细胞群。同年,Anderson等^[14]利用流式细胞术成功纯化出重要的TECs亚群。尽管这些研究为TECs的研究提供了重要信息,但是由于成年小鼠TECs的低频性以及之间的紧密作用,使得其分离纯化过程一直是研究的重点^[15]。本研究优化了传统的分离富集协议,有效地富集了成年小鼠TECs,并将细胞活力丢失降到了最低。本实验结果表明:经典消化浓度1.0 g·L^-1的collagenase Ⅴ对胸腺组织的消化时间过长,致使细胞活力大量丢失,加之有文献报道^[16]胶原酶消化体系很不稳定,常常会导致同生小鼠TSCs的细胞数以及比例变化不定,因此胶原酶对胸腺组织的消化能力欠佳;而Liberase^TM属于温和的混合型胶原酶^[17],在实验中显示出较快、较完全和较稳定的胸腺消化能力,并且对忽略不计的外毒素含量可以将细胞活力丢失降到最低,得到活性更高的TSCs。尽管Liberase^TM的传统消化浓度是0.5 U·mL^{-1[3, 5, 9]},但本研究发现:将Liberase^TM的消化浓度增加至1.0 U·mL^-1时,TSCs的产量增加;然而,当工作浓度超过1.0 U·mL^-1时,TSCs的产量不再增加。因此,1.0 U·mL^-1是Liberase^TM消化成年小鼠胸腺组织的最适工作浓度。此外,在TECs分离的过程中,建议注意以下4点:①提取胸腺后要立即进行处理,确保在处理组织的过程中剔除血块及结缔组织,否则在流式细胞术检测过程中会出现自发荧光;②Liberase^TM 和collagenase Ⅴ工作液需要现用现配,否则酶易失活,影响TSCs的产量;③对于汇集胸腺来说,要根据胸腺数量,选用最适的酶溶液体积,首次消化时间段不宜过长,否则TSCs的产量会降低;④在流式细胞术检测过程中确保FSC∶SSC门中要包含淋巴细胞群,否则会漏掉许多淋巴细胞大小的TECs。总之,有效的分离方法可以确保TECs最适的细胞产量及其准确的体内代表性。

本研究的富集实验结果显示:与对照组比较,Percoll、MACS和Ficoll富集组均可以显著增加活细胞中TECs的比例,并且3个富集组细胞活力均较高,说明其富集方法都比较温和,对细胞的伤害较小。MACS富集组虽然可以大量富集TSCs,但是这群TSCs中EpCAM标志的表达丰度较低;Ficoll富集组虽然可以有效地富集TSCs中的TECs,但是富集过程可能会导致大量的TSCs丢失;而Percoll富集组显示出较综合的富集优势,可以同时富集TSCs与TECs,而且所富集的TECs是3个富集组中比例最高的。因此,根据TECs的富集效果,排序应该是:Picoll法 > MACS法 > Ficoll法。此外,Percoll富集后可以捕获高纯度的异源cTECs和mTECs亚群,且未影响2个亚群的比值,甚至更为脆弱的cTECs亚群的比例也仍接近于对照组,说明Percoll富集过程温和,确保了亚群表型的准确性、无偏差性,对后续的实验操作十分有利。

然而,目前的研究仍以MACS法为主要的TECs富集方法^[7],本研究证实了MACS法虽可以获得高纯度的TSCs,但是TSCs中TECs的比例较低,而Percoll法可以互补地富集TSCs中的TECs。因此,如果将MACS与Percoll富集法结合使用,可能很大程度地实现对TECs的富集。首先,建议结合方法采用Liberase^TM 1.0 U·mL^-1消化胸腺组织;其次,可以先进行MACS分选除去大量的CD45⁺ 胸腺细胞,富集TSCs,再将得到的TSCs进行Percoll富集,这样可以大大提高TECs的纯度。但是,这个结合方法可否实现无偏差富集,是否引起TECs丢失加倍甚至影响cTECs和mTECs的比例,仍有待深入研究。

综上所述,Liberase^TM非常适用于TECs的分离过程,且1.0 U·mL^-1是其分离成年小鼠TECs的最适Liberase工作浓度。此外,本研究中的3种TECs富集方法都可以明显富集TECs且对细胞的破坏均较小,其中Percoll富集法是3种方法中最有效的,而且并未改变TECs亚群的比例,进而可以为下游如Real-time PCR、基因谱系分析等高精度的研究提供高纯度的TECs。