精神分裂症是一种复杂的神经发育障碍性疾病,影响世界上0.4%~0.6%的人口,并以具有阳性症状和阴性症状为特点^[1]。遗传学变异、表观遗传突变和环境因素可能共同参与了精神分裂症这种复杂的神经发育障碍性疾病的发生,因此寻找精神分裂症的易感基因是当前精神分裂症研究领域的关键。目前许多研究^{[2, 3, 4, 5]}证明: 磷脂、游离脂肪酸和胆固醇等脂类物质,参与神经系统疾病的病理学。在偏执型精神分裂患者中,血清甘油三酯和超低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein,VLDL)浓度明显升高^[2],且在精神分裂症患者中存在代谢综合征^[6]。同时有研究^[7]发现:在不同人群、不同种族中磷脂酶A₂(phospholipase A₂,PLA₂)基因与精神分裂症明显相关,这就进一步证实精神分裂症神经细胞膜磷脂代谢异常假说,也提示精神分裂症与脂代谢基因间可能存在一定的联系。

脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase,LPL)是甘油三酯水解的关键酶,广泛表达于大脑组织中参与学习、记忆和认知等功能的区域。LPL 缺乏或活性异常导致的高甘油三酯血症是血脂异常、2型糖尿病、高血压、冠心病以及阿尔茨海默病等临床常见疾病的高危因素之一^[8]。此外,全基因组关联研究和相关研究^[9]均表明:人类染色体8p22区域与精神分裂症相关,而LPL基因定位于此。有相关性研究^[3]也表明:在中国汉族人群中,LPL基因与精神分裂症明显相关。因此,LPL是精神分裂症的一个有吸引力的候选基因。本研究选择LPL基因作为侯选基因,首次采用精神分裂症大鼠模型,研究脑组织中LPLmRNA的表达情况,进一步探讨其在精神分裂症发病机制中的可能作用,旨在进一步阐明精神分裂症的发病机制,寻找其可能的生物学标记,该方面的研究在国内外尚未见报道。

总RNA提取用Trizol购自美国Invitrogen 公司,cDNA逆转录试剂盒和SYBR Premix Ex Taq^TM试剂盒均购自日本TaKaRa宝生物工程(大连)公司。实时定量PCR仪(MX 3000P)为美国Stratagene公司产品,紫外分析仪为美国Beckman公司产品。

选择围产期Wistar大鼠(购于吉林大学实验动物中心),动物许可证号:SCXK(吉)20130001。大鼠分为对照组21只,模型组24只。模型组大鼠在出生后7、9和11 d以皮下注射的方式给予10 mg·kg^-1 苯环已哌啶(phencyclidine,PCP)处理,建立精神分裂症动物模型。动物模型建立完成后,断头处死大鼠,分别取前脑皮层(prefrontal cortex,PC)、杏仁核(amygdala,AM)、尾壳核(caudate-putamen,CPU)和海马(hippocampus,HIP)4个脑区的脑组织。

通过Morris水迷宫实验进行大鼠行为学及认知检测,同时验证精神分裂症动物模型是否建立成功。Morris水迷宫是选择一直径为180 cm,高为50 cm,水深为30 cm的不锈钢圆形水池,水温要求控制在(23.0±0.5)℃,加适量奶粉于水中,使水变浑浊,不透明为标准。池壁边缘标示出4个入水点,并将水池等分为NE、SE 、NW及SW 4个象限,放置1个直径11 cm、高28 cm的平台在SE象限正中央。摆放丰富的空间参照物于水池四周、天棚、四周墙壁及迷宫周围挂物所提供的空间线索始终固定不变。每次将大鼠投放入迷宫后,随即避开大鼠视线。任选一入水点,将大鼠面向池壁放入水中,将其在3 min内寻找到平台的时间记录,即隐匿平台逃避潜伏期(escape latency)。如果大鼠在3 min内不能找到平台,则引导大鼠至平台上,停留20 s,以让其能够逐渐学习并记忆到达平台的路途和位置。每天2次,每次3遍,连续2 d,将第3天的平均成绩作为实验数据。

①总RNA的提取和浓度测定:取大鼠脑组织0.1~0.2 g,采用Trizol法提取组织RNA,按照Trizol操作说明书步骤进行。采用紫外分析仪测定260nm处吸光度(A)值。②反应体系与反应条件:体系中加入2 μL 5 × Reaction Buffer,0.5 μL Oligo (dT)₁₈、2 μL Random 6 mers、0.5 μL PrimeScript^TM RT Enzyme Mix和1 μg总RNA,DEPC水补充体积至10 mL。37℃、 15 min,85℃、5s,-20℃保存备用。③引物的设计及合成:LPL和GAPDH基因序列均参照GenBank,采用Primer 5设计引物,并委托上海生工公司合成。引物序列见表 1。

① SYBR Green 实时荧光定量PCR扩增绘制熔解曲线:取最适稀释浓度的样本cDNA 2 μL,加入2 × SYBR Premix Ex Taq^TM 12.5 μL,50 × ROX Reference Dye 0.5 μL,分别加入LPL和GAPDH基因上、下游引物各0.5 μL (10 μmol·L^-1),DEPC水9 μL,总反应体系25 μL。反应条件:95℃、5 min,95℃ 、20 s,60℃、 60 s,共40个循环;95℃、15 s,60℃、15 s,95℃、15 s。60℃和95℃之间,每上升0.5℃读取1次Ct值,生成熔解曲线,熔解曲线应为完全单一峰,该引物才可以进行实时荧光定量PCR的检测,如不符合要求,则需要重新设计并合成其他引物。②SYBR Green 实时荧光定量PCR样品模板浓度的优化:取混合样品的cDNA分别稀释至4、16和64和256倍。在体系中加入,不同稀释浓度的样本cDNA 2 μL,10 μmol·L^-1的F和R引物各0.5 μL,50 × ROX Reference Dye 0.5 μL,2 × SYBR Premix Ex Taq^TM 12.5 μL,DEPC水9 μL,总反应体系为25 μL。将不同样本置于96孔板内,在MX 3000P荧光定量PCR仪上行PCR扩增及荧光定量,检测目的基因LPL和内参基因(GAPDH)在不同浓度稀释样本中的扩增情况。反应条件:95℃、5 min,95℃、 20 s,60℃、60 s,共40个循环。③ 采用2^-ΔΔCt 法检测LPL基因相对表达水平:通过相对定量2^-ΔΔCt法计算目的基因相对于内参基因表达水平的倍数,比较基因的表达差异。ΔCt = Ct (target gene)-Ct (GAPDH),ΔΔCt= ΔCt (target gene)-ΔCt (calibrator)。

采用SPSS11.5统计分析软件包进行统计学分析。大鼠到达平台的时间、脑组织中LPL mRNA表达水平均以x ±s表示,两样本均数组间比较采用Student-t检验。

模型组和对照组大鼠到达平台的时间分别为(122.62±13.83)和(28.86±8.09) s,与对照组比较,模型组大鼠找到平台的时间明显延长,模型组为对照组的4.25倍(P<0.01)。

大鼠脑组织中PC、AM、CPU和HIP 4个脑区中LPL mRNA表达水平结果显示:与对照组比较,模型组大鼠PC和HIP脑区中LPL mRNA表达水平明显降低(P<0.05),分别下降了61.7%和89.0%。见表 2。

神经细胞膜假说是精神分裂症的发病机制之一,神经细胞膜的重要组成部分包括二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)和花生四烯酸(arachidonic acid,AA),在神经发育过程中多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)缺乏可导致多种诸如精神分裂症和多动症等这类复杂的疾病^[4]。研究^[5]发现: 精神分裂症的膜磷脂代谢异常,主要表现为多不饱和脂肪酸的水平降低,尤其是花生四烯酸和二十二碳六烯酸,而在血清、血小板、脑组织中PLA₂活性增强,可能与精神分裂症患者的前列腺素信号受损有关。

人类LPL基因位于8p22,长约36 000 bp,由10个外显子和9个内含子组成,其广泛地表达于大脑、脊髓和外周神经等组织中,在被阻断供血动脉或外力挫伤的大脑以及周围神经组织中,LPL 表达量明显增加,并参与损伤神经组织的修复^[8]。LPL是一种糖蛋白,主要由肌肉、心脏及脂肪等组织合成和分泌,活化状态的LPL可催化乳糜微粒(CM)和高密度脂蛋白(VLDL)中的甘油三酯(TG)水解,产生CM和高密度脂蛋白(HDL)残基,同时释放出脂肪酸和单酰甘油。此外,LPL也可以促进HDL水平的提高,其基因表达受转录、转录后调控机制影响^{[10, 11, 12, 13]}。

本研究结果显示: 在大鼠精神分裂症动物模型中,LPL基因在模型组大鼠PC和HIP2个脑区表达下降。本研究结果表明:在精神分裂症的易病变脑区,LPL的表达均发生改变,提示在精神分裂症的发病过程中,LPL基因很可能起着一定的作用,也就是说LPL基因与精神分裂症的病理过程存在着某种联系。然而,LPL基因表达受转录及转录后机制的双重影响,可能是遗传学与表观遗传学机制单独或共同参与了精神分裂症的LPL基因表达异常^[14]。同时,LPL蛋白也存在多种形式,其活化形式又有许多的功能。因此要阐明LPL基因与精神分裂症的关系还需进一步深入研究。

另一方面,LPL基因表达也存在转录后调控机制,提示还需要考虑到表观遗传机制对LPL基因表达的影响,所以DNA甲基化和组蛋白修饰研究将是下一步研究的重点。综合遗传学和表观遗传学结果将有助于解释LPL基因在精神分裂症发病机制中的作用。

综上所述,本研究在精神分裂症动物模型中发现LPL基因在脑部易变区域表达异常,揭示LPL基因与精神分裂症存在一定的联系,为今后的遗传学和表观遗传学研究结果的联合分析奠定了基础。