2020, Vol. 46扩展功能
文章信息
- 魏旭静, 李林, 张红真, 王景, 徐静
- WEI Xujing, LI Lin, ZHANG Hongzhen, WANG Jing, XU Jing
- LncRNA CCAT1通过TGF-β/Smad信号通路对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响
- Effects of LncRNA CCAT1 on proliferation, invasion and migration of endometrial cancer cells through TGF-β1/smad signaling pathway
- 吉林大学学报(医学版), 2020, 46(05): 1016-1022
- Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2020, 46(05): 1016-1022
- 10.13481/j.1671-587x.20200519
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文章历史
- 收稿日期: 2019-09-23
子宫内膜癌是女性常见的恶性肿瘤，其发病机制复杂，探讨其发生发展机制对其诊治及改善其预后具有重要价值。近年来，子宫内膜癌细胞增殖、侵袭迁移及其分子机制方面的研究取得了巨大进步，长链非编码核糖核酸（long non coding RNA，LncRNA）在胚胎发育、基因表达和肿瘤发生等过程中发挥重要作用，多种LncRNA参与子宫内膜癌的发生发展过程[1]。近年来研究[2]发现：LncRNA CCAT1在多种恶性肿瘤的增殖和侵袭迁移过程中发挥重要作用，在子宫内膜癌中的作用也受到研究者关注，YU等[3]研究发现：LncRNA CCAT1可促进子宫内膜癌细胞的增殖和迁移。但其通过何种信号通路在子宫内膜癌发生发展中发挥作用尚不清楚。转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）/Smad信号通路参与子宫内膜癌的增殖及侵袭迁移过程，SAHOO等[4]研究显示：抑制细胞外基质介导的TGF-β信号转导可抑制子宫内膜癌的转移。本实验通过观察沉默CCAT1对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和迁移及TGF-β/Smad信号通路的影响，探讨其在子宫内膜癌中的可能作用机制。
1 材料与方法 1.1 细胞、主要试剂和仪器人子宫内膜癌Ishiwaka细胞株和正常人子宫内膜基质细胞T-HESC（中国科学院上海细胞库）；Lipofectamine 2000试剂盒（美国Invitrogen公司），CCAT1模拟物siRNA（CCAT1-siRNA）和阴性对照模拟物siRNA（广州博锐生物科技公司），ECL化学发光试剂盒、逆转录（RT）试剂盒、Trizol试剂、聚合酶链反应（PCR）试剂盒、LY364947（TGF-β/ Smad抑制剂）和结晶紫（美国Sigma公司），CCK8试剂、胰蛋白酶和DMEM培养基（美国BPB公司），兔抗人增殖细胞核抗原（PCNA）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、锌指转录因子（snail）、凋亡抑制蛋白（Twist）、白细胞抑制因子2/3（Smad2/3）、磷酸化Smad 2/3（p-Smad2/3）、转化生长因子β1（TGF-β1）和兔抗人TGF-β1单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；MultiskanTM FC酶标仪、Applied Biosystems PCR仪和NERLTM流式细胞仪（美国赛默飞世尔科技公司），Transwell小室（美国TaKaRa公司）等。
1.2 细胞培养Ishiwaka细胞和T-HESC细胞置于DMEM（含双抗和10%胎牛血清）培养，细胞贴壁后每2 d换液1次，细胞生长至达80%以上融合时进行细胞传代培养。
1.3 实时荧光定量PCR（RT-PCR）法检测Ishiwaka细胞和T-HESC细胞中CCAT1 mRNA表达水平取Ishiwaka和T-HESC细胞，加入Trizol裂解液裂解细胞，提取细胞总RNA，将RNA逆转录为cDNA，PCR法检测细胞中CCAT1 mRNA表达水平；CCAT1上游引物：5'-CCATTCCATTCAT-TTCTCTTTCCTA-3'，下游引物：5'-GGCGTA-GGCGATTGGGGATCG-3'。PCR反应条件：95℃、30 s；95℃、5 s，58℃、30 s，72℃、30 s，共42个循环。以U6为内参照。每组设7个复孔。以2－∆∆Ct法计算细胞中CCAT1 mRNA表达水平。
1.4 细胞分组和转染取对数生长期的Ishiwaka细胞分为空白对照组、阴性对照组、CCAT1-siRNA组和CCAT1-siRNA+LY364947组，将各组对数生长期的Ishiwaka细胞接种到6孔细胞培养板中，每孔2×105个细胞，培养至细胞达90%以上融合时进行转染，阴性对照组转染阴性对照siRNA，CCAT1-siRNA组转染CCAT1-siRNA，CCAT1-siRNA + LY364947组转染CCAT1-siRNA同时加入LY364947（3 µL）[5]，空白对照组不转染。转染步骤严格参照Lipofectamine 2000试剂盒说明书进行。转染24 h后采用RT-PCR法检测细胞中CCAT1 mRNA表达水平，方法同“1.2”。
1.5 CCK8法检测Ishiwaka细胞增殖能力取各组生长良好的Ishiwaka细胞接种到96孔细胞培养板中，每孔5×103个细胞，培养24、48和72 h时每孔分别加入10 µL的CCK8试剂，继续培养2 h，每组设7个复孔。酶标仪检测450 nm波长处各孔吸光度（A）值，以A值表示细胞增殖能力。
1.6 Transwell小室实验检测各组侵袭细胞数和迁移细胞数取各组生长状态良好的Ishiwaka细胞用双无培养基悬浮，将含血清的正常培养基加入24孔细胞培养板中，将24孔细胞培养板放入Transwell小室，调整各组细胞个数，使200 µL培养液中含5×104个细胞，将各组细胞放入Transwell小室培养24 h，然后取出小室，甲醇固定30 min，棉签擦去内室细胞，用结晶紫染色30 min，纤维镜下观察迁移细胞数。侵袭实验在实验前用基质胶包被小室，其余步骤同迁移实验。
1.7 Western blotting法检测Ishiwaka细胞中PCNA、E-cadherin、vimentin、snail、Twist、Smad2/3、p-Smad2/3和TGF-β1蛋白表达水平取各组转染24 h细胞加入蛋白裂解液提取细胞总蛋白，BCA法检测细胞蛋白浓度。取100 µg蛋白电泳，经转膜、5%脱脂奶粉封闭，加入一抗：兔抗人PCNA、E-cadherin、vimentin、snail、Twist、Smad2/3、p-Smad2/3和TGF-β1单克隆抗体，稀释比例1：200，过夜孵育。加入二抗（1：5 000）孵育2 h，以β-actin为内参，化学发光法显色，每组设7个复孔，凝胶电泳成像仪采集图像，Quantity One软件分析条带灰度值。目标蛋白表达水平=目标蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值。
1.8 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。不同细胞中CCAT1 mRNA表达水平、各组细胞增殖能力、迁移细胞数、侵袭细胞数以及细胞中PCNA、E-cadherin、vimentin、snail、Twist、Smad2/3、p-Smad2/3和TGF-β1蛋白表达水平经检验均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 不同细胞中CCAT1mRNA表达水平Ishiwaka细胞中CCAT1 mRNA表达水平（1.94±0.17）明显高于T-HESC细胞（1.00±0.09）（t =12.929，P < 0.01）。
2.2 各组Ishiwaka细胞中CCAT1 mRNA表达水平与空白对照组（1.00±0.08）和阴性对照组（0.99±0.10）比较，CCAT1-siRNA组和CCAT1-siRNA + LY364947组Ishiwaka细胞中CCAT1 mRNA表达水平（0.52±0.06和0.49±0.07）明显降低（P < 0.01），空白对照组与阴性对照组及CCAT1-siRNA组与CCAT1-siRNA + LY364947组Ishiwaka细胞中CCAT1表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。
2.3 各组Ishiwaka细胞增殖能力培养24 h，各组Ishiwaka细胞增殖能力比较差异均无统计学意义（P>0.05）；培养48和72 h，与空白对照组和阴性对照组比较，CCAT1-siRNA组和CCAT1-siRNA+ LY364947组Ishiwaka细胞增殖能力明显降低（P < 0.05），与CCAT1-siRNA组比较，CCAT1-siRNA+LY364947组Ishiwaka细胞增殖能力明显降低（P < 0.05），空白对照组与阴性对照组Ishiwaka细胞比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表 1。
| (n＝7, x±s) | |||||||||||||||||||||||||||||
| Group | A value | ||||||||||||||||||||||||||||
| (t/h) 24 | 48 | 72 | |||||||||||||||||||||||||||
| Blank control | 0.28±0.07 | 0.55±0.08 | 0.86±0.12 | ||||||||||||||||||||||||||
| Negative control | 0.27±0.09 | 0.57±0.09 | 0.85±0.13 | ||||||||||||||||||||||||||
| CCAT1-siRNA | 0.23±0.06 | 0.42±0.06*△ | 0.60±0.10*△ | ||||||||||||||||||||||||||
| CCAT1-siRNA+LY364947 | 0.22±0.05 | 0.31±0.05*△# | 0.46±0.08*△# | ||||||||||||||||||||||||||
| F | 1.271 | 20.06 | 22.595 | ||||||||||||||||||||||||||
| P | 0.31 | < 0.01 | < 0.01 | ||||||||||||||||||||||||||
| *P < 0.05 compared with blank control group; △P < 0.05 compared with negative control group; # P < 0.05 compared with CCAT1-siRNA group. | |||||||||||||||||||||||||||||
与空白对照组和阴性对照组比较，CCAT1-siRNA组和CCAT1-siRNA + LY364947组Ishiwaka细胞中侵袭细胞数和迁移细胞数明显降低（P < 0.05）；与CCAT1-siRNA组比较，CCAT1-siRNA + LY364947组Ishiwaka细胞侵袭细胞数和迁移细胞数明显降低（P < 0.05），空白对照组与阴性对照组Ishiwaka细胞中侵袭细胞数和迁移细胞数比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表 2、图 1（插页五）和图 2（插页五）。
| (n＝7, x±s) | |||||||||||||||||||||||||||||
| Group | Number of invasion cells | Number of migration cells | |||||||||||||||||||||||||||
| Blank control | 50.24±4.16 | 46.15±3.97 | |||||||||||||||||||||||||||
| Negative control | 51.43±3.98 | 47.02±3.73 | |||||||||||||||||||||||||||
| CCAT1-siRNA | 36.48±3.52*△ | 24.16±3.52*△ | |||||||||||||||||||||||||||
| CCAT1-siRNA + LY364947 | 21.43±3.26*△# | 18.26±3.42*△# | |||||||||||||||||||||||||||
| F | 98.494 | 114.873 | |||||||||||||||||||||||||||
| P | < 0.01 | < 0.01 | |||||||||||||||||||||||||||
| *P < 0.05 compared with blank control group; △P < 0.05 compared with negative control group; # P < 0.05 compared with CCAT1-siRNA group. | |||||||||||||||||||||||||||||
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| A: Blank control group; B: Negative control group;C:CCATl-siRNA group; D:CCAT1-siRNA十LY36494 group. 图 1 Transwell 小室法测定各组 Ishiwaka 细胞侵袭能力(结晶紫，×200) Fig. 1 Invasive abilities of Ishiwaka cells in var1ous groups determined by Transwell chamber(Crystal violet, ×200) |
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| A: Blank control group; B: Negative control group;C:CCATl-siRNA group; D:CCAT1-siRNA十LY36494 group. 图 2 Transwell 小室测定各组 Ishiwaka 细胞迁移能力 (结晶紫，×200) Fig. 2 Migration capacities of Ishiwaka cells in various groups determined by Transwell chamber (Crystal violet, ×200) |
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与空白对照组和阴性对照组比较，CCAT1-siRNA组和CCAT1-siRNA + LY364947组Ishiwaka细胞中PCNA、vimentin、snail和Twist蛋白表达水平均明显降低（P < 0.05），E-cadherin蛋白表达水平明显升高（P < 0.05）；与CCAT1-siRNA组比较，CCAT1-siRNA + LY364947组Ishiwaka细胞E-cadherin蛋白表达水平明显升高（P < 0.05），其他蛋白表达水平均明显降低（P < 0.05），但空白对照组与阴性对照组Ishiwaka细胞中上述蛋白表达水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表 3和图 3。
| （n＝7，x±s） | |||||||||||||||||||||||||||||
| Group | PCNA | E-cadherin | vimentin | snail | Twist | ||||||||||||||||||||||||
| Blank control | 0.83±0.17 | 0.18±0.07 | 0.58±0.11 | 0.85±0.12 | 0.51±0.08 | ||||||||||||||||||||||||
| Negative control | 0.79±0.15 | 0.21±0.08 | 0.56±0.09 | 0.86±0.14 | 0.49±0.07 | ||||||||||||||||||||||||
| CCAT1-siRNA | 0.26±0.05*△ | 0.56±0.11*△ | 0.27±0.03*△ | 0.64±0.08*△ | 0.33±0.05*△ | ||||||||||||||||||||||||
| CCAT1-siRNA+LY364947 | 0.12±0.03*△# | 0.74±0.14*△# | 0.18±0.02*△# | 0.32±0.07*△# | 0.24±0.04*△# | ||||||||||||||||||||||||
| F | 67.275 | 48.55 | 53.515 | 39.533 | 30.591 | ||||||||||||||||||||||||
| P | < 0.01 | < 0.01 | < 0.01 | < 0.01 | < 0.01 | ||||||||||||||||||||||||
| *P < 0.05 compared with blank control group; △P < 0.05 compared with negative control group; # P < 0.05 compared with CCAT1-siRNA group. | |||||||||||||||||||||||||||||
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| Lane 1:Blank control group; Lane 2:Negative control group; Lane 3:CCAT1-siRNA group; Lane 4:CCAT1-siRNA + LY364947 group. 图 3 Western blotting法检测Ishiwaka细胞中PCNA、E-cadherin、vimentin、snail和Twist蛋白表达电泳图 Fig. 3 Expression levels of PCNA, E-cadherin, vimentin, snail and Twist proteins in Ishiwaka cells in virous groups determined with Western blotting method |
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与空白对照组和阴性对照组比较，CCAT1-siRNA组和CCAT1-siRNA + LY364947组Ishiwaka细胞中p-Smad2/3和TGF-β1蛋白表达水平明显降低（P < 0.05）；与CCAT1-siRNA组比较，CCAT1-siRNA + LY364947组Ishiwaka细胞中p-Smad2/3和TGF-β1蛋白表达水平明显降低（P < 0.05）；空白对照组与阴性对照组Ishiwaka细胞中p-Smad2/3和TGF-β1蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P> 0.05）。见图 4和表 4。
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| Lane 1:Blank control group; Lane 2:Negative control group; Lane 3:CCAT1-siRNA group; Lane 4:CCAT1-siRNA + LY364947 group. 图 4 Electrophoregram of expressions of Smad2/3, p-Smad2/3 and TGF-β1 proteins in Ishiwaka cells in various groups determined by Western blotting method |
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| (n＝7, x±s) | |||||||||||||||||||||||||||||
| Group | Smad2/3 | p-Smad2/3 | TGF-β1 | ||||||||||||||||||||||||||
| Blank control | 0.82±0.13 | 0.71±0.12 | 0.64±0.12 | ||||||||||||||||||||||||||
| Negative control | 0.84±0.12 | 0.73±0.13 | 0.61±0.11 | ||||||||||||||||||||||||||
| CCAT1-siRNA | 0.85±0.14 | 0.37±0.05*△ | 0.25±0.03*△ | ||||||||||||||||||||||||||
| CCAT1-siRNA+LY364947 | 0.87±0.15 | 0.26±0.04*△# | 0.18±0.02*△# | ||||||||||||||||||||||||||
| F | 0.165 | 44.894 | 57.41 | ||||||||||||||||||||||||||
| P | 0.92 | < 0.01 | < 0.01 | ||||||||||||||||||||||||||
| *P < 0.05 compared with blank control group; △P < 0.05 compared with negative control group; # P < 0.05 compared with CCAT1-siRNA group. | |||||||||||||||||||||||||||||
LncRNA是非编码RNA家族成员，长度大于200 nt，不具备蛋白质编码功能，在染色质修饰、表观遗传和转录调控等多方面发挥重要调控作用，可促进蛋白基因表达，也可抑制基因表达[6]。近年来研究[7-8]显示：多种LncRNA与恶性肿瘤的发生发展关系密切，在恶性肿瘤的发生发展中发挥抑癌或促癌作用，与靶蛋白组织的复杂的调控网络在细胞增殖、分化、凋亡和侵袭迁移中发挥重要的调控作用。LncRNA CCAT1位于c-Myc的一个增强子区，在多种恶性肿瘤中异常表达[9]，与多种恶性肿瘤的预后关系密切，如CCAT1可靶向miR-219a调节宫颈癌HeLa细胞生长、侵袭和迁移[10]；激活CCAT1可通过调节SPRY4和HOXB13在食管鳞状细胞癌中的表达影响食管鳞状细胞癌细胞增殖和迁移[11]；LncRNA CCAT1可被c-Myc激活促进胰腺癌细胞增殖和迁移[12]。潘洪丽等[13]对子宫内膜癌细胞中LncRNA CCAT1表达研究发现：子宫内膜癌组织中LncRNA CCAT1呈高水平表达，沉默子宫内膜癌细胞中LncRNA CCAT1水平可抑制子宫内膜癌细胞的侵袭和迁移。本文作者对子宫内膜癌Ishiwaka细胞中LncRNA CCAT1水平研究发现：Ishiwaka细胞中LncRNA CCAT1 mRNA表达水平升高，沉默Ishiwaka细胞LncRNA CCAT1表达可抑制子宫内膜癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。但LncRNA CCAT1在子宫内膜癌中的作用机制尚不清楚。
多种信号通路参与子宫内膜癌的发生发展过程，其中TGF-β/Smad信号通路为子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和迁移过程中的重要通路之一。TGF-β/Smad信号通路在肿瘤的发生发展中发挥抑制和促进肿瘤进展的双重作用，在恶性肿瘤的起始阶段，TGF-β/Smad信号通路可抑制恶性肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡，从而抑制恶性肿瘤的发展；在恶性肿瘤的晚期，TGF-β/Smad信号通路可促进肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡，从而促进恶性肿瘤的进展和转移过程[14]。TGF-β/Smad信号通路在恶性肿瘤的发生发展中，通过调节上皮间质转化（EMT）导致恶性肿瘤细胞免疫逃避、细胞转移和诱导血管生成等，促进恶性肿瘤的进展[15-16]。
LncRNA CCAT1可通过多种信号通路参与恶性肿瘤的发生发展，如LncRNA CCAT1通过激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信号通路影响胃癌细胞的增殖、凋亡、侵袭和迁移过程[17]；LncRNA CCAT1在恶性肿瘤中的作用与CCAT1可影响恶性肿瘤细胞EMT有关[18]；LncRNA CCAT1通过miR-490-3p上调TGF-β受体1从而促进TGF-β1诱导的卵巢癌细胞EMT[19]。LncRNA CCAT1可通过TGF-β诱导细胞EMT，EMT在细胞的侵袭迁移中发挥重要作用[20]，因此推测LncRNA CCAT1在子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和迁移中的作用可能与TGF-β/Smad信号通路及EMT有关。本研究结果显示：沉默CCAT1及加入TGF-β/Smad信号抑制剂均可降低细胞中PCNA、E-cadherin、vimentin、snail、Twist、p-Smad2/3和TGF-β1蛋白表达水平，细胞中E-cadherin蛋白表达水平升高。PCNA在细胞核中合成，检测细胞中PCNA蛋白水平可用于评价细胞的增殖状态[21]。E-cadherin为重要的维持上皮细胞表型的细胞间黏附分子，E-cadherin表达缺失或者表达降低是EMT的重要标志[22]。Vimentin为间质细胞的标志物，其水平升高也是EMT的标志物[23]。snail和Twist为TGF-β/Smad信号通路的上游转录因子，二者水平升高可促进TGF-β/Smad信号通路激活[24-25]。p-Smad2/3和TGF-β1蛋白表达水平可反映TGF-β/Smad信号通路状况，p-Smad2/3和TGF-β1蛋白表达水平升高表明TGF-β/Smad信号通路激活；反之，p-Smad2/3和TGF-β1蛋白水平降低表明TGF-β/Smad信号通路受到抑制。因此，本研究中沉默CCAT1及加入TGF-β/Smad信号抑制剂均可抑制子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和迁移，降低细胞中PCNA、E-cadherin、vimentin、snail、Twist、p-Smad2/3和TGF-β1蛋白表达水平，细胞中E-cadherin蛋白表达水平升高，表明沉默CCAT1抑制子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和迁移的机制可能与抑制TGF-β/Smad信号通路激活、从而抑制子宫内膜癌细胞EMT有关。
综上所述，沉默LncRNA CCAT1对子宫内膜癌细胞的增殖、侵袭和迁移具有抑制作用，其机制可能与沉默LncRNA CCAT1可抑制子宫内膜癌细胞TGF-β/Smad信号通路活化从而抑制EMT有关。
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