子宫内膜癌是常见的妇科恶性肿瘤，其发病率高，占女性生殖系统恶性肿瘤的25%~35%^[1]。临床上对子宫内膜癌的治疗手段主要有手术治疗、孕激素治疗和化学药物治疗等^[2-4]，多数子宫内膜癌患者经过治疗后预后良好，但仍有部分晚期患者出现复发，且复发患者预后较差^[5]。研究^[6]表明：子宫内膜癌患者预后不良的主要原因是出现癌细胞侵袭和转移。因此，对子宫内膜癌细胞侵袭和转移的生物学指标展开研究具有重要意义。基因靶向治疗是近年来有效治疗恶性肿瘤的方法，具有靶向性强和不良反应少的特点。整合素连接激酶（integrin-linked kinase，ILK）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在多种恶性肿瘤组织中其表达水平均明显升高，可通过多条信号转导途径参与肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移等生物行为过程^[7-8]。目前，国内外关于ILK与子宫内膜癌关系方面的研究较少。本研究旨在观察ILK在子宫内膜癌组织和细胞中的表达情况，分析其对子宫内膜癌细胞侵袭和转移的影响及其可能的作用机制，为寻求抑制子宫内膜癌细胞侵袭和转移提供新靶点。

人子宫内膜癌HEC-1B细胞购自中科院上海细胞库。DMEM培养基购自美国Sigma公司，胰蛋白酶购自美国Gibco公司，ILK siRNA由武汉晶赛公司提供，免疫组织化学SP试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid disodium，BCA）蛋白定量试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司，鼠抗人ILK单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，兔抗人蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）和糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）多克隆抗体、磷酸化Akt（p-Akt）和磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β）多克隆抗体及GAPDH多克隆抗体均购自美国Abcam公司，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG购自北京中杉金桥公司。MM-800型光学显微镜（日本尼康公司），DYCZ-24KS型双板垂直电泳仪（北京六一生物科技有限公司）。

选取2018年1月－2019年1月本院收治的29例手术切除子宫内膜癌患者，所有患者病理诊断明确，术前均未接受过放化疗或药物干预治疗，患者年龄35~74岁，平均年龄（51.37 ± 10.30）岁。取子宫内膜癌组织和癌旁正常组织置于－80℃冰箱中保存。本研究经本院伦理委员会批准，并取得患者知情同意。

取子宫内膜癌组织和癌旁正常组织，采用免疫组织化学SP法染色，严格按说明书操作。阳性判断标准：每张切片随机取5个视野计数100个肿瘤细胞，按其着色强度与阳性细胞数评分并求均值。着色强度评分标准：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞百分率：无阳性细胞为0分，0% < 阳性细胞数≤4%为1分，4% < 阳性细胞数≤24%为2分，24% < 阳性细胞数≤49%为3分，阳性细胞数>49%为4分。以两者得分乘积>3分为（+），表示该病例显示阳性反应。

将子宫内膜癌HEC-1B细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养液，于37℃、饱和湿度及5% CO₂培养箱中培养。当细胞密度达到80%时，用0.25%的胰蛋白酶消化传代。细胞培养至对数生长期后，胰蛋白酶消化，采用细胞培养液调整细胞浓度为每毫升3 × 10⁴个细胞，以每孔1 mL接种于6孔细胞培养板中，细胞生长至融合度为80%时，采用Lipofectamine 2000转染细胞，分别作为干扰组和空载组，同时以转染的细胞为对照组，转染48 h。

用细胞裂解液裂解细胞20 min，12 000 r•min^－1离心15 min，提取各组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白含量。酶标仪测定各组蛋白含量并配平，使各组蛋白终浓度为5 g • L^–1。每个加样孔加样50 μg，采用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，电泳，转膜。于37℃封闭2 h，采用鼠抗人ILK单克隆抗体（1︰300）和兔抗人Akt多克隆抗体（1︰1 000）、p-Akt多克隆抗体（1︰1 000）、GSK-3β多克隆抗体（1︰1 000）、磷酸化的GSK-3β（p-GSK-3β）（1︰1 000）和GAPDH（1︰10 000），4℃孵育过夜，TBST漂洗，37℃孵育山羊抗兔IgG（1︰10 000）二抗20 min，TBST漂洗，ECL试剂显色，Bio-Rad发光系统呈像，检测分析条带灰度值，目的蛋白相对表达水平＝目的蛋白条带灰度值/ GAPDH条带灰度值。

干扰组、空载组和对照组细胞培养至对数生长期后，以每毫升2 × 10⁵个细胞铺于6孔细胞培养板，培养过夜，待细胞完全贴壁后，吸除上清液，用200 μL移液枪枪头划出细胞刮痕，用无血清培养基洗涤划下的细胞。加入细胞培养液，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养24 h。在倒置显微镜下观察0和24 h划痕宽度，计算细胞迁移距离。细胞迁移距离＝0 h划痕宽度－24 h划痕宽度。

将基质胶加入到24孔Transwell小室中，并将其小室置于37℃培养箱中湿化3 h，待基质胶凝固后，加入不含胎牛血清的细胞培养液继续孵育40 min。取细胞悬浮液加入小室的上室，在小室的下室加入750 μL含有胎牛血清的细胞培养液。培养24 h后，取出小室，用棉签将非入侵性细胞擦掉，采用甲醇和苏木素染色将通过膜和黏膜下表面迁移的细胞固定。在显微镜下随机选取6个视野，观察侵袭细胞数，以侵袭细胞数反映细胞侵袭能力。

采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。子宫内膜癌和癌旁正常组织中ILK阳性表达率以百分率（%）表示，2组间百分率比较采用χ²检验。各组细胞中ILK、Akt、p-Akt、GSK-3β和p-GSK-3β蛋白表达水平，细胞迁移距离及侵袭细胞数均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

29例子宫内膜癌和癌旁正常组织中，23例癌组织ILK为（+），阳性表达率为79.3%；3例癌旁正常组织ILK为（+），阳性表达率为10.3%，ILK在子宫内膜癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁正常组织（P < 0.05）。

与对照组和空载组比较，干扰组细胞ILK蛋白的表达水平明显降低，约降低60%。见图 1。

Lane 1 : Control group; Lane 2 : Empty vector group; Lane 3 : Interference group.*P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs empty vector group. 图 1 各组细胞中ILK蛋白表达电泳图 Fig. 1 Electrophoregram of expressions of ILK protein in cells in various groups

图选项

与对照组和空载组比较，干扰组细胞迁移距离明显缩短（P < 0.05），表明干扰组细胞迁移能力明显降低；与对照组和空载组比较，干扰组侵袭细胞数明显减少（P < 0.05），表明干扰组细胞侵袭能力明显降低。见表 1、图 2和图 3（插页五）。

A-C:0 h; D-F:24 h.A, D: Control group; B, E: Empty vector group; C, F: Interference group. 图 2 细胞划痕实验检测各组细胞迁移情况（×100） Fig. 2 Migration of cells in various groups detected by cell scratch test (×100)

图选项

A: Control group; B: Empty vector group; C: Interference group. 图 3 各组细胞 Transwell 小室实验结果(甲醇和苏木素, ×200) Fig. 3 Results of Transwell chamber assay of cells in various groups ( Methanol and hematoxylin, × 200)

图选项

与对照组和空载组比较，干扰组p-Akt和p-GSK-3β蛋白表达水平明显降低（P < 0.05），Akt和GSK-3β蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。见表 2和图 4。

Lane 1 : Control group; Lane 2 : Empty vector group; Lane 3 : Interference group. 图 4 各组细胞中Akt、p-Akt、GSK-3β和p-GSK-3β蛋白表达电泳图 Fig. 4 Electrophoregram of expressions of Akt, p-Akt, GSK-3β, and p-GSK-3β proteins in cells in various groups

图选项

ILK是一种多功能的细胞内信号蛋白，能协调细胞外基质和生长因子的信号转导，调控细胞的增殖、分化、迁移、侵袭和血管生成^[9-11]。上皮-间质细胞转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是导致子宫内膜癌发生转移的直接原因，ILK蛋白作为EMT调控蛋白，主要通过诱导肿瘤细胞的EMT过程介导肿瘤细胞的迁移和侵袭^[12]。研究^{[8, 13-15]}表明：ILK蛋白在上皮性卵巢癌、子宫颈癌和胰腺癌等癌组织中过度表达，其患者预后差。本研究结果显示：在子宫内膜癌患者组织中ILK蛋白阳性表达率明显高于癌旁正常组织，与同类型研究^[16]结果一致。

Akt是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是PI3K/Akt通路中的主要活性物质，参与血管形成、基因转录、细胞迁移和细胞周期调控等生物过程，与其下游调节因子GSK-3β共同参与细胞凋亡过程。p-GSK-3β可通过抑制促凋亡蛋白的蛋白线粒体转位，从而抑制细胞凋亡，促进肿瘤的发生发展^[17]。研究^[18-19]表明：ILK能够结合并磷酸化整合素β1亚单位，激活PIK3/Akt信号通路，磷酸化Akt。p-Akt能够降低GSK-3β活性，改变细胞周期，抑制细胞凋亡。本研究结果显示：沉默ILK基因后，p-Akt和p-GSK3β表达水平明显降低，GSK-3β的表达水平升高但差异无统计学意义。本研究结果表明：抑制ILK蛋白的表达能够阻断Akt/GSK-3β信号通路相关蛋白磷酸化，调控细胞周期，促进细胞凋亡。另外，siRNA沉默ILK基因后子宫内膜癌HEC-1B细胞的迁移和侵袭能力明显下降，与前期研究^[20]结果一致，表明抑制ILK表达能够抑制肿瘤的发生和转移。

综上所述，ILK蛋白在子宫内膜癌患者组织中呈高水平表达，抑制子宫内膜癌HEC-1B细胞中ILK蛋白表达能够抑制细胞的迁移和侵袭能力，其机制可能与通过调控Akt/GSK-3β途径抑制Akt和GSK-3磷酸化有关。本研究结果将为ILK作为子宫内膜癌新的抗肿瘤治疗靶基因提供实验依据。