吉林大学学报(医学版)  2020, Vol. 46 Issue (05): 992-997     DOI: 10.13481/j.1671-587x.20200515

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隋欣, 徐岩, 周佳, 王伟楠, 张明天, 韩冬, 李娜, 杨擎, 曲晓波, 黄晓巍
SUI Xin, XU Yan, ZHOU Jia, WANG Weinan, ZHANG Mingtian, HAN Dong, LI Na, YANG Qing, QU Xiaobo, HUANG Xiaowei
鹿茸Ⅰ型胶原对骨髓间充质干细胞增殖的影响及其与Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖表达的关系
Effects of velvet antler collagen typeⅠ on proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells and its relationships with type Ⅱ collagen and aggrecan expressions
吉林大学学报(医学版), 2020, 46(05): 992-997
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2020, 46(05): 992-997
10.13481/j.1671-587x.20200515

文章历史

收稿日期: 2020-01-05
鹿茸Ⅰ型胶原对骨髓间充质干细胞增殖的影响及其与Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖表达的关系
隋欣1 , 徐岩2 , 周佳2 , 王伟楠3 , 张明天1 , 韩冬2 , 李娜4 , 杨擎4 , 曲晓波2 , 黄晓巍2     
1. 长春中医药大学附属医院实验中心, 吉林 长春 130117;
2. 长春中医药大学药学院临床药学与中药药理教研室, 吉林 长春 130117;
3. 长春中医药大学药学院药物化学与中药化学教研室, 吉林 长春 130117;
4. 长春中医药大学吉林省人参科学研究院药理组, 吉林 长春 130117
[摘要]: 目的: 观察鹿茸Ⅰ型胶原(VACTⅠ)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及细胞周期的影响,探讨其与Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖表达的关系。方法: 选取健康雄性4周龄SD大鼠,差时贴壁法提取BMSCs并传代培养。实验分为空白对照组、转化生长因子β3(TGF-β3)(10μg·L-1)组和不同浓度(1.25、2.50、5.00、10.00和20.00 g ·L-1)VACTⅠ组,CCK-8法检测各组BMSCs增殖率,ELISA法检测各组细胞上清液中骨形态生成蛋白4(BMP-4)和转录因子Sox9水平,流式细胞术检测各组不同细胞周期BMSCs百分率,RT-PCR法和Western blotting法分别检测各组细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA和蛋白表达水平。结果: 与空白对照组比较,2.50~20.00 g·L-1 VACTⅠ组大鼠BMSCs增殖率明显降低(P < 0.05或P < 0.01);ELISA法,与空白对照组比较,TGF-β3组和不同浓度VACTⅠ组细胞上清液中BMP-4和Sox9水平明显升高(P < 0.05或P < 0.01);流式细胞术,与空白对照组比较,TGF-β3组和不同浓度VACTⅠ组不同细胞周期BMSCs百分率差异无统计学意义(P>0.05);RT-PCR法,与空白对照组比较,TGF-β3组和不同浓度VACTⅠ组细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA表达水平明显升高(P < 0.05);Western blotting法,与空白对照组比较,TGF-β3组和不同浓度VACTⅠ组细胞Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖蛋白表达水平明显升高(P < 0.05或P < 0.01)。结论: VACTⅠ可促进BMSCs释放BMP-4和Sox9,提高Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖表达水平,抑制BMSCs增殖,是一种潜在的成软骨分化诱导剂。
关键词: 鹿茸Ⅰ型胶原    骨髓间充质干细胞    成软骨    Ⅱ型胶原    聚集蛋白聚糖    
Effects of velvet antler collagen typeⅠ on proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells and its relationships with type Ⅱ collagen and aggrecan expressions
SUI Xin1 , XU Yan2 , ZHOU Jia2 , WANG Weinan3 , ZHANG Mingtian1 , HAN Dong2 , LI Na4 , YANG Qing4 , QU Xiaobo2 , HUANG Xiaowei2     
1. Experimental Center, Affiliated Hospital, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China;
2. Department of Clinical Pharmacy and Pharmacology of Chinese Medicine, School of Pharmacy, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China;
3. Department of Medicinal Chemistry and Chinese Medicine Chemistry, School of Pharmacy, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China;
4. Department of Pharmacology, Jilin Ginseng Academy, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China
[ABSTRACT]: Objective To observe the effects of velvet antler collagen type Ⅰ (VACT Ⅰ) on the proliferation and cell cycle of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs), and to explore its relationships with the expressions of type Ⅱ collagen and aggrecan. Methods: The healthy male SD rats aged 4 weeks were chosen and the BMSCs were extracted by differential adhesion method and cultivated. The experiment was divided into blank control group, transforming growth factor β3(TGF-β3) (10 μg·L-1) group, and different concentrations (1.25, 2.50, 5.00, 10.00, and 20.00 g·L-1) of VACT I groups. CCK-8 assay was used to detect the proliferation rates of BMSCs in various groups. The levels of bone morphogenetic protein-4 (BMP-4) and transcription factor Sox9 in the cell supernatant in various groups were detected by ELISA method. The percentages of BMSCs in different cell cycles in various groups were detected by flow cytometry. The expression levels of type Ⅱ collagen and aggrecan mRNA and proteins in BMSCs in various groups were detected by RT-PCR and Western blotting methods, respectively. Results: Compared with blank control group, the proliferation rates of BMSCs of the rats in 2.50-20.00 g·L-1 VACT Ⅰ groups were significantly decreased (P < 0.05 or P < 0.01). The ELISA results showed that compared with blank control group, the levels of BMP-4 and Sox9 in the cell supernatant of the rats in TGF-β3 group and different concentrations of VACTⅠ groups were significantly increased (P < 0.05 or P < 0.01). The flow cytometry results showed that compared with blank control group, the percentages of BMSCs in different cell cycles of the rats in TGF-β3 group and different concentration of VACT Ⅰ groups had no significant differences(P>0.05). The RT-PCR results showed that compared with blank control group, the mRNA expression levels of type Ⅱ collagen and aggrecan in TGF-β3 group and different concentrations of VACT Ⅰ groups were significantly increased (P < 0.05). The Western blotting results showed that compared with blank control group, the expression levels of type Ⅱ collagen and aggrecan proteins in TGF-β3 group and different concentrations of VACTⅠ groups were significantly increased (P < 0.05 or P < 0.01). Conclusion: VACTⅠcan promote the release of BMP-4 and Sox9 from cells, increase the expression levels of type Ⅱ collagen and aggrecan, and inhibit the proliferation of BMSCs. It is a potential chondrogenic differentiation inducer.
KEYWORDS: velvet antler collagen type Ⅰ    bone marrow mesenchymal stem cells    chondrogenesis    type Ⅱ collagen    aggrecan    

随着现代社会人口老龄化问题的日益加剧,软骨损伤因具有难以修复、病程长且易反复等特点,现已成为影响老年人生活质量的主要因素之一[1-2]。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一类具有多向分化潜能的多能干细胞,可在特定条件下分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等,转化生长因子和黄酮类化合物等诱导剂可以促进这一过程的发生,甚至产生靶向作用[3-5]。梅花鹿鹿茸是吉林省道地优势药材,具有“强筋骨”之功效,近千年来一直被广泛应用于各类骨病治疗[6]。鹿茸中含有大量的胶原蛋白,其中Ⅰ型胶原蛋白约占90%,已被证实作为医用生物材料对缺损组织修复、再生和重建具有重要意义[7]。但鹿茸Ⅰ型胶原(velvet antler collagen type Ⅰ,VACTⅠ)是否具有诱导BMSCs成软骨分化的作用目前尚无报道。本研究通过体外细胞实验,观察VACTⅠ对BMSCs增殖、细胞周期以及成软骨相关因子骨形态生成蛋白4(BMP-4)、转录因子Sox9、Ⅱ型胶原(type Ⅱ collagen)和聚集蛋白聚糖(aggrecan)的影响,探讨其诱导BMSCs成软骨化的潜在可能及其机制。

1 材料与方法 1.1 实验动物、主要试剂和仪器

4周龄SD大鼠,雄性,清洁级,由长春亿斯实验动物技术有限责任公司提供,动物生产许可证号:SCXK(吉)2016-0003。VACTⅠ由长春中医药大学提供;兔抗大鼠Ⅱ型胶原(货号:15943-1-AP)、兔抗大鼠聚集蛋白聚糖(货号:13880-1-AP)和山羊抗兔二抗HRP(货号:SA00001-2)购于武汉三鹰生物技术有限公司,SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(货号:P1200)、全蛋白提取试剂盒(货号:BC3711)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号:PC0020)、ECL化学发光法检测试剂盒(货号:SW2010)和彩虹245广谱蛋白Marker(货号:PR1920)购于北京索莱宝科技有限公司,增强型CCK-8试剂盒(货号:BA00208)购于北京博奥森生物技术有限公司。Multiskan FC型酶标仪(美国Thermo公司),Alliance Q9型凝胶成像仪(英国UVItec公司),Gallios型流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司),Nanodrop 2000型微量分光光度计(美国Thermo公司),CFX Connect型荧光定量PCR仪和CFX Manager型采集及分析软件(美国Bio-Rad公司)。

1.2 大鼠BMSCs的原代及传代培养

大鼠脱颈椎处死后75%酒精浸泡10 min,超净工作台中切取双侧股骨,75%酒精浸泡2 min,移入新的超净工作台中,剪去两端干骺端用PBS缓冲液反复冲洗出骨髓细胞至离心管中,800 r•min-1离心5 min,收集BMSCs,接种于含10%FBS和100 U • mL-1双抗的DMEM培养基中,在37℃、5% CO2和饱和湿度条件下培养,差时贴壁法纯化细胞,待细胞生长至80%~90%时,使用含EDTA的0.25%胰酶消化传代,取第3~5代细胞用于实验。

1.3 CCK-8法检测BMSCs增殖率

取第3代BMSCs,用胰蛋白酶消化后以每孔3 × 104个细胞的密度接种于96孔细胞培养板中,每孔1 mL,孵育24 h后分别加入条件培养液。实验分为空白对照组、转化生长因子β3(TGF-β3)组(给予浓度为10 μg•L-1 TGF-β3)和不同浓度VACTⅠ(给药浓度分别为1.25、2.50、5.00、10.00和20.00 g • L-1)组。连续培养24、48和72 h后,弃去培养液,每孔加入CCK-8 10 µL和DMEM 190 µL,孵育4 h,酶标仪检测450 nm处吸光度(A)值。细胞增殖率=实验组A值/空白对照组A值。

1.4 ELISA法检测细胞上清液中BMP-4和Sox9水平

按照武汉酶免生物科技有限公司ELISA试剂盒说明书检测各组细胞上清液中BMP-4和Sox9水平,于450 nm波长处依次读取各孔的A值。以标准品浓度为横坐标,A值为纵坐标制作标准曲线,求出回归方程,计算各样品水平。

1.5 流式细胞术检测各组不同细胞周期细胞百分率

制备浓度为1 × 106 mL-1的细胞悬液1 mL,离心后去上清,在细胞中加入70%预冷乙醇500 μL固定2 h,4℃保存,染色前用PBS缓冲液洗去固定液。加入100 μL RNase A溶液,重悬细胞,37℃水浴30 min,再加入400 μL PI染色液混匀,4℃避光孵育30 min,流式细胞术检测各组不同细胞周期细胞百分率。

1.6 RT-PCR法检测各组细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA表达水平

按美国Axygen公司提供的AxyPrep总RNA小量制备试剂盒提取各组细胞总RNA,NanoDrop 2000超微量分光光度计测定总RNA浓度。按照日本TaKaRa公司提供的逆转录试剂盒操作规程逆转录合成cDNA第一链,‒20℃储存备用。以cDNA链作为模板,进行PCR扩增反应,反应体系:5×iScript Reaction Mixture 4 μL,iScript Reverse Transcriptase 1 μL,RNA template 1 μg,加Nuclease-free water至20 μL;反应条件:37℃孵育60 min,85℃孵育5 min,冰浴5 min,合成的cDNA于‒20℃储存备用。以cDNA链作为模板,进行PCR扩增反应,20 μL反应体系:iTaqTM universal SYBR Green supermix(2×)10 μL,Forward and reverse primers 1.8 μL,DNA template 1 μL,加H2O至20 μL。反应条件:95℃预变性5 min;95℃变性10 s,60℃退火30 s,72℃延伸1 min,40循环扩增反应后,72℃、5 min。将96孔细胞培养板放入荧光定量PCR仪中,并在Bio-Rad CFX Manager软件上设定检测。PCR引物序列见表 1

表 1 PCR引物序列 Tab. 1 Sequences of PCR primers
Primer Sequence(5'-3')
Aggrecan F:GAACCTACGGCATCCGGGACA
R:CCTCACCGCCCACTCCAAAGA
Type Ⅱ collagen F:ACGCCACGCTCAAGTCCCTCAA
R:TGTGTTTCGTGCAGCCATCCTG
β-actin F:CTGTGTGGATTGGTGGCTCT
R:CAGCTCAGTAACAGTCCGCC
1.7 Western blotting法检测各组细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖蛋白表达水平

提取各组细胞总蛋白,采用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测样品蛋白浓度,调节浓度为2 g•L-1,将蛋白样品与2×样品缓冲液按体积比1:4混合后,100℃水浴5 min;制备SDS-PAGE凝胶,每孔加样20 μL,280 mA恒定电流转膜60 min。转膜结束后,取出PVDF膜,采用TBST洗涤3次,每次5 min,之后将膜放入5%脱脂奶粉中,水平摇床,室温下封闭2 h。封闭结束后,TBST浸洗3次,每次5 min,分别加入Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖一抗(1:1 000)稀释液,4℃储存,过夜。加HRP标记二抗(1:2 000),水平摇床,室温封闭2 h。加入ECL发光显色液后将膜正面朝上放到凝胶成像仪内,记录结果。对电泳条带进行灰度值扫描,对各目的蛋白进行半定量分析。以目的蛋白条带灰度值与内参条带灰度值比值表示目的蛋白表达水平。

1.8 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。各组BMSCs增殖率,细胞中BMP-4和Sox9水平,不同细胞周期细胞百分率,细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA及蛋白表达水平以x±s表示,多组间样本均数比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK-q检验。检验水准为α=0.05。

2 结果 2.1 各组BMSCs增殖率

与空白对照组比较,1.25 g • L-1 VACTⅠ组大鼠BMSCs增殖率差异无统计学意义(P>0.05),2.50~20.00 g•L-1 VACTⅠ组大鼠BMSCs增殖率明显降低(P < 0.05或P < 0.01),并呈时间剂量依赖性;与TGF-β3组比较,2.50 g•L-1 VACTⅠ组大鼠BMSCs增殖率差异无统计学意义(P >0.05),故选用2.5和5.0 g • L-1 VACTⅠ组进行后续实验。见表 2

表 2 各组BMSCs增殖率 Tab. 2 Proliferation rates of BMSCs in various groups 
(n=5, x±s)
Group Proliferation rate
(t/h) 24 48 72
Blank control 1.152±0.036 1.276±0.045 1.380±0.051
TGF-β3 0.995±0.027** 1.087±0.058** 1.195±0.059**
VACTⅠ(g•L-1)
                  1.25 1.178±0.040 1.275±0.061 1.362±0.075
                  2.50 1.038±0.034** 1.115±0.056* 1.193±0.068*
                  5.00 0.917±0.031** 1.026±0.051** 1.104±0.062**
                10.00 0.795±0.040** 0.872±0.048** 0.955±0.059**
                20.00 0.624±0.028** 0.733±0.039** 0.829±0.043**
    *P < 0.05, **P < 0.01 compared with blank control group.
2.2 各组BMSCs上清液中BMP-4和Sox9水平

与空白对照组比较,TGF-β3组和不同浓度VACTⅠ组细胞上清液中BMP-4和Sox9水平明显升高(P < 0.05或P < 0.01)。见表 3

表 3 各组BMSCs上清液中BMP-4和Sox9水平 Tab. 3 Levels of BMP-4 and Sox9 in cell supernatant of BMSCs in various groups 
[n=5, x±s, ρB/(ng•L-1)]
Group BMP-4 Sox9
Blank control 225.82±30.45 98.48±10.85
TGF-β3 298.42±32.18* 150.28±12.48**
VACTⅠ(g•L-1)
  2.5  295.58±29.80* 153.18±14.29**
  5.0  310.68±42.25* 189.05±19.62**
    *P < 0.05, **P < 0.01 compared with blank control group.
2.3 各组不同细胞周期BMSCs百分率

与空白对照组比较,TGF-β3组和不同浓度VACTⅠ组不同细胞周期BMSCs百分率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表 4图 1插页四)。

表 4 各组不同细胞周期BMSCs百分率 Tab. 4 Percentages of BMSCs in different cell cycles in various groups 
(n=5, x±s, η/%)
Group Percentage of BMSCs
G0/G1 S G2/M
Blank control 46.59±5.29 38.20±2.59 15.21±2.08
TGF-β3 46.04±4.26 37.41±3.09 16.55±1.98
VACTⅠ(g•L-1)
  2.5 45.25±3.95 39.01±3.85 15.74±1.65
  5.0 47.72±4.08 39.23±2.96 13.05±3.15
A: Blank group; B: TGF-β3 group;C:2.50 g·L1 VACT group; D:5.00 g.L1 VACT group. 图 1 流式细胞术检测各组不同细胞周期BMSCs百分率 Fig. 1 Percentages of BMSCs in different cell cycles in various groups detected by flow cytometry
2.4 各组细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA表达水平

与空白对照组比较,TGF-β3组和不同浓度VACTⅠ组细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA表达水平明显升高(P < 0.05)。见图 2表 5

A:Amplification curve of type Ⅱ collagen; B:Amplification curve of aggrecan; C:Relative mRNA expression of type Ⅱ collagen; D:Relative mRNA expression of aggrecan.*P < 0.05 compared with blank control group. 图 2 RT-PCR法检测各组细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA表达水平 Fig. 2 Expression levels of type Ⅱ collagen and aggrecan mRNA in cells in various groups detected by RT-PCR method
表 5 各组细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA表达水平 Tab. 5 Expression levels of type Ⅱ collagen and aggrecan mRNA in cells in various 
(n=5, x±s)
Group Type Ⅱ collagen /β-actin Aggrecan /β-actin
Blank control 1.00 1.00  
TGF-β3 1.31±0.11* 1.52±0.12*
VACTⅠ(g•L-1)
  2.5 1.38±0.12* 1.48±0.13*
  5.0 1.46±0.10* 1.54±0.12*
    *P < 0.01 compared with blank control group.
2.5 各组细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖蛋白表达水平

与空白对照组比较,TGF-β3组和不同浓度VACTⅠ组细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖蛋白表达水平明显升高(P < 0.05或P < 0.01)。见表 6图 3

表 6 各组细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖蛋白表达水平 Tab. 6 Expression levels of collagen type Ⅱ and aggrecan proteins in cells in various groups 
(n=5, x±s)
Group Type Ⅱ collagen /β-actin Aggrecan /β-actin
Blank control 0.322±0.042 0.581±0.053
TGF-β3 0.520±0.051** 0.789±0.081*
VACTⅠ(g•L-1)
  2.5 0.583±0.060** 0.872±0.102*
  5.0 0.601±0.052** 0.820±0.092*
    *P < 0.05,**P < 0.01 compared with blank control group.
Blank control group; Lane 2: TGF-β3 group; Lane 3, 4: 2.5 and 5.0 g•L-1 VACT Ⅰ groups. 图 3 Western blotting法检测各组细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖蛋白表达电泳图 Fig. 3 Electrophoregram of expressions of type Ⅱ collagen and aggrecan proteins in cells in various groups detected by Western blotting method
3 讨论

骨折是骨质疏松最严重的并发症,严重影响老年人生活质量,其愈合过程及机制不同于一般骨折,在手术治疗的同时应给予必要的抗骨质疏松治疗及促软骨生成[8-9]。BMSCs具有来源广、多向分化潜能且应用技术成熟等特点,是软骨组织工程修复最理想的工具。通过诱导剂靶向诱导BMSCs成软骨分化是现代研究的热点,目前常用的诱导剂包括骨形态发生蛋白2(BMP-2)、地塞米松和TGF-β3等;此外巴戟天多糖、柚皮苷和淫羊藿苷等中药提取物也具有诱导剂的潜质[10-13]。鹿茸作为中药传统名贵药材,具有壮肾阳、益精血、强筋骨、调冲任和托疮毒之功效,一直以来作为宫廷药膳食材应用历史悠久[14]。研究[15]表明:胶原是哺乳动物体内含量最多的一类蛋白质,具有很高的生物学活性,鹿茸中含有丰富的Ⅰ型胶原,已被证实对多种骨病具有治疗作用。

本研究结果表明:2.5~20.0 g • L-1 VACTⅠ对大鼠BMSCs增殖率起到不同程度的抑制作用,且细胞增殖率与时间和剂量呈负相关关系。BMP-4在肥大软骨细胞和成熟的骨细胞中广泛表达,可以促进软骨组织早期形成,而Sox9是软骨发育形成中的重要转录因子,在软骨的发育成熟等过程中发挥重要的调节作用[16-17]。本研究中ELISA法检测结果表明:VACTⅠ诱导可促进细胞释放BMP-4和Sox9,VACTⅠ在抑制BMSCs增殖的同时具有诱导其向软骨细胞分化的潜质。Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖蛋白是Sox9调控的下游靶点蛋白,也是软骨组织的特征性蛋白,二者表达增加是软骨组织修复的标志过程[18-20]。本研究中RT-PCR法和Western blotting法检测结果表明:VACTⅠ可上调BMSCs中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达水平,但诱导过程中各组细胞周期未发生明显变化。

综上所述,VACTⅠ可通过提高BMSCs中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖表达水平抑制其增殖,是一种潜在的成软骨分化诱导剂。

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