脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）具有自我更新和多向分化潜能，可用于再生或修复骨组织^[1]。与骨髓来源的间充质干细胞比较，ADSCs组织来源更丰富，细胞增殖速度更快^[2]。然而，尽管有大量研究ADSCs可分化为多种谱系，但ADSCs分化的分子机制仍不明了。长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）和微小RNA（miRNA）在成骨细胞分化中起关键作用^[3-4]。研究^[5]表明：LncRNA-KCNQ1OT1通过激活Wnt/β-catenin通路促进成骨分化以减弱骨溶解。LncRNA H19的异常表达与成骨分化有关^[6]。细胞实验^[7]表明：LncRNA肺癌转移相关转录本1（metastasis-associated lung ademocarcinoma transcript 1，MALAT1）通过抑制miR-204的表达，促进成骨细胞特异性标志物碱性磷酸酶（ALP）、骨钙蛋白（OCN）和矿化的骨基质形成。研究^[8]表明：miRNA参与调节成骨细胞和破骨细胞分化过程。miR-34c通过调节成骨细胞中特异AT序列结合蛋白2（special AT-rich sequence binding protein 2，SATB2）和Runt相关转录因子2（Runx2）等多个靶点，影响成骨细胞和破骨细胞在体内的骨稳态^[9]。过表达SATB2可以促进乙醇诱导的骨坏死患者骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchyml stem cells，BMSCs）的成骨分化^[10]。目前，LncRNA MALAT1在ADSCs成骨分化中的作用尚不清楚。本研究旨在探讨LncRNA MALAT1通过miR-34c/SATB2轴在ADSCs成骨分化中的作用，以期为明确LncRNA MALAT1调控ADSCs成骨分化的机制和骨损伤的治疗提供科学指导。

原代人ADSCs购自美国ScienCell公司，HEK-293T细胞购自中国典型培养物保藏中心。DMEM培养基购自美国Hyclone公司，胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司，青链霉素混合液（100×）购自北京索莱宝科技有限公司，Lipofectamine 3000转染试剂购自美国Invitrogen公司，SYBRPremix Ex Taq^TMⅡ试剂盒购自日本TaKaTa公司，BCA蛋白定量试剂盒购自北京全式金公司，lentiviral-pEF-1a/Puro-NC（Lenti-NC）、lentiviral-pEF-1a/Puro-MALAT1（Lenti-MALAT1）、lentiviral-pEF-1a/Puro- SATB2（Lenti-SATB2）、lentiviralpGLVU6/Puro-sh-NC（sh-NC）、lentiviralpGLVU6/Puro-sh-MALAT1（sh-MALAT1）、miR-NC和miR-34c mimic（miR-34c）均购自上海GenePharma公司，油红O和茜素红购自美国Sigma公司，FITC-CD44抗体、FITC-CD29抗体、PE-CD90抗体、PE-CD105抗体和PE-vWF抗体购自美国BD公司，Runx2抗体、OPN抗体和OCN抗体购自英国Abcam公司。倒置相差显微镜购自日本Nikon公司，实时荧光定量PCR仪购自瑞士Roche公司，微量分光光度计购自美国Thermo Scientific公司。

ADSCs和HEK-293T细胞用含10% FBS、100 IU·mL^－1青霉素和100 mg·L^－1链霉素的DMEM培养基中，于37℃、5% CO₂条件下培养。

诱导ADSCs成骨分化：当ADSCs长至80%~90%密度时，将培养基替换为成骨细胞特异性诱导培养基（含10%FBS，10 mmol·L^－1 β-甘油磷酸钠，0.1 μmol·L^－1地塞米松和0.2 mmol·L^－1抗坏血酸磷酸的低糖DMEM），每2 d更换1次培养基，于37℃、5%CO₂条件下培养0、3、7、14和21 d。诱导ADSCs成脂分化：当ADSCs长至80%~90%密度时，将培养基替换为成脂细胞特异性诱导培养基（含10%FBS，10 mmol·L^－1 β-甘油磷酸钠，1 μmol·L^－1地塞米松，0.5 mmol·L^－1 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，10 μmol·L^－1胰岛素和200 μmol·L^－1吲哚美辛的低糖DMEM），每2 d更换1次培养基，于37℃、5%CO₂条件下培养14 d。

ADSCs成骨诱导培养基培养21 d后，弃去细胞培养基，PBS缓冲液清洗后，4%多聚甲醛固定，0.1% Triton X-100穿透，10%脱脂奶粉封闭，FITC-CD44抗体（1︰200）、FITC-CD29抗体（1︰200）、PE-CD90抗体（1︰200）、PE-CD105抗体（1︰200）和PE-vWF抗体（1︰200）避光孵育2 h，DAPI染色，荧光显微镜下观察细胞发光情况。

ADSCs弃去成脂诱导培养基，PBS缓冲液清洗后，4%多聚甲醛固定。PBS缓冲液清洗细胞后，0.3%油红O室温染色20 min。弃去染液，蒸馏水洗涤后，显微镜观察并拍照。

ADSCs弃去成骨诱导培养基，根据BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒说明书检测细胞中ALP水平，酶标仪405 nm处检测各组细胞吸光度（A）值，对ALP水平进行定量。计算公式：ALP水平＝[（样品组A值－空白组A值）－（对照组A值－空白组A值）]/（对照组A值－空白组A值）。

收集转染后的ADSCs，TRIzol法提取样品中的总RNA，分光光度计测定RNA浓度，逆转录合成cDNA。按照SYBRPremix Ex Taq^TMⅡ试剂盒说明书进行RT-PCR法检测。反应条件：95℃、30 s；95℃、5 s，58℃、30 s，40个循环；95℃、15 s，58℃、30 s，95℃、15 s。以U6和GAPDH为内参，采用2^－ΔΔCt法计算miR-34c表达水平和LncRNA MALAT1、SATB2、Runx2、OPN及OCN mRNA表达水平。引物序列见表 1。

成骨诱导后的ADSCs或293T细胞接种于6孔细胞培养板，每孔4×10⁵个细胞，待细胞密度达到60%~70%时，按照Lipofectamine 3000说明书进行miR-34c和miR-NC的转染，终浓度均为60 nmol·L^－1。37℃、5%CO₂条件下培养48 h。ADSCs转染慢病毒时，将细胞培养液更换为含6 mg·L^－1聚凝胺和感染复数（MOI）＝20的lentiviral-pEF-1a/Puro-NC（Lenti-NC）、lentiviral-pEF-1a/Puro-MALAT1（Lenti-MALAT1）、lentiviral-pEF-1a/Puro-SATB2（Lenti- SATB2）、lentiviralpGLVU6/Puro-sh-NC（sh-NC）和lentiviralpGLVU6/Puro-sh-MALAT1（sh-MALAT1）慢病毒的新鲜培养基，37℃、5%CO₂条件下培养48 h。

miRcode（http://www.miRcode.org/）预测MALAT1与miR-34c的靶向结合位点，TargetScan 7.1（http://www.TargetScan.org/vert_/）预测miR-34c和SATB2之间的靶向结合位点。针对LncRNA MALAT1 3'-UTR端和SATB2 3'-UTR端序列构建野生型（WT）和突变型（MUT）报告基因质粒。参照“1.8”步骤，将MALAT1-WT和MALAT1-MUT（或SATB2-WT和SATB2-MUT）分别与miR-NC和miR-34c共同转染至HEK-293T细胞中，48 h后检测荧光素酶活性。

弃去ADSCs成骨诱导培养基，PBS缓冲液清洗后，4%多聚甲醛固定。PBS缓冲液清洗细胞后，0.1%ARS染色液室温孵育20 min。弃去染液，蒸馏水洗涤。为了定量钙盐沉积，向细胞中加入含有10 mmol·L^－1磷酸钠的10%氯化十六烷基吡啶，并用酶标仪检测各样品在562 nm处的A值。ARS水平＝[（样品组A值－空白组A值）－（对照组A值－空白组A值）]/（对照组值－空白组A值）。

收集转染后的ADSCs或293T细胞，BCA法测定蛋白浓度，取30 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，并将其转至PVDF膜上。10%脱脂奶粉室温封闭3 h，加入Runx2（1︰1 500）、OPN（1︰1 000）、OCN（1︰2 000）和GAPDH（1︰2 000），4℃孵育过夜。HRP标记二抗（1︰2 500）室温孵育1 h后，ECL发光、曝光。Image J分析条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值与GAPDH条带灰度值比值表示目的蛋白表达水平。

采用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析。各组细胞中荧光素酶活性，LncRNA MALAT1、miR-34、SATB2、Runx2、OPN和OCN表达水平，ALP和ARS水平均以x±s表示，2组间样本均数比较采用两独立样本t检验，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

ADSCs中间充质干细胞标记物CD29、CD90、CD44和CD105呈阳性表达，而内皮细胞标记物vWF呈阴性表达（图 1A~F，见插页二）；同时细胞具有长丝状结构（图 2A，见插页三），表明该细胞是ADSCs。油红O染色法和ALP染色检测结果显示：在成脂或成骨诱导条件下，ADSCs中有红色脂滴形成（图 2B，见插页三）和橘红色钙盐沉积（图 2C，见插页三）。

A: CD29; B: CD90; C: CD44; D: CD105; E: vWF [labeled with FITC (green color) or PE (red color)]; F: Negative control. 图 1 免疫荧光染色检测ADSCs中CD29.CD90、CD44.CD105和vWF的表达(× 400) Fig. 1 Expressions of CD29, CD90, CD44, CD105 and vWF in ADSCs detected by immunofluorescence staining(× 400)

图选项

A: Typical cobblestone-like morphology of ADSCs; B: Oil red Ostaining; C: Alizarin red staining. 图 2 ADSCs多向分化潜能的鉴定(× 200) Fig. 2 Identification of multi- differentiation potential of ADSCs(× 200)

图选项

与第0天比较，ADSCs成骨诱导第3、7、14和21天后细胞中LncRNA MALAT1和SATB2及成骨标记物Runx2、OPN和OCN mRNA表达水平均明显升高（P < 0.05），miR-34c mRNA表达水平明显降低（P < 0.05）。见图 3。

*P < 0.05, **P < 0.01 vs day 0. 图 3 成骨分化过程中ADSCs中LncRNA MALAT1（A）、miR-34c（B）、SATB2（C）、OPN（D）、OCN（E）和Runx2（F）mRNA表达水平 Fig. 3 Expression levels of LncRNA MALAT1 (A), miR-34c (B), SATB2 (C), OPN (D), OCN(E), and Runx2(F) mRNA in ADSCs during osteogenie differentiation

图选项

与Lenti-NC组比较，Lenti-MALAT1组ADSCs中Runx2、OPN和OCN蛋白表达水平明显升高（P < 0.01），见图 4A，LncRNA MALAT1蛋白表达水平明显升高（P < 0.01），见图 4B，ALP和ARS活水平明显升高（P < 0.01），见图 5（插页三）和图 6；与sh-NC组比较，sh-MALAT1组ADSCs中Runx2、OPN和OCN蛋白表达水平明显降低（P < 0.01），见图 4A，MALAT1蛋白表达水平明显降低（P < 0.01），见图 4B，ALP和ARS水平明显降低（P < 0.01），见图 5（插页三）和图 6。

Lane 1: Lenti-NC group; Lane 2: Lenti-MALAT1 group; Lane 3: sh-NC group; Lane 4: sh-MALAT1 group. *P < 0.05, **P < 0.01 vs Lenti-NC group; △P < 0.01 vs sh-NC group. 图 4 各组ADSCs中LncRNA MALAT1、Runx2、OPN和OCN蛋白表达电泳图（A）和直条图（B, C） Fig. 4 Electrophoregram (A) and histogram (B, C) of expressions of MALAT1, Runx2, OPN and OCN proteins in ADSCs in various groups

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图 5 ALP和ARS染色检测ADSCs中ALP活性和钙盐沉积 Fig. 5 ALP activities and calcium salt deposition in ADSCs detected by ALP and ARS staining

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*P < 0.01 vs Lenti-NC group; △P < 0.05, △△P < 0.01 vs sh-NC group. 图 6 各组ADSCs中ALP和ARS水平 Fig. 6 Levels of ALP and ARS in ADSCs in various groups

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LncrRNA MALAT1与miR-34c结合位点见图 7A。荧光素酶报告实验结果显示：与miR-NC组比较，miR-34c转染后MALAT1-WT组荧光素酶活性明显降低（P < 0.01），MALAT1-MUT组荧光素酶活性差异无统计学意义（P > 0.05，见图 7B）。与miR-NC+Lenti-NC组比较，miR-34c+Lenti-NC组ADSCs中miR-34c表达水平明显升高（P < 0.01，见图 7C），LncRNA MALAT1表达水平明显降低（P < 0.05，见图 7C），Runx2、OPN和OCN蛋白表达水平明显降低（P < 0.01），见图 8，ALP和ARS水平明显降低（P < 0.01，见图 9（插页三）和图 10，miR-34c+Lenti-MALAT1组ADSCs中miR-34c、MALAT1表达水平及Runx2、OPN和OCN表达水平，ALP和ARS水平差异无统计学意义（P > 0.05）。

B:*P < 0.05, **P < 0.01 vs miR-NC group; C:*P < 0.05, **P < 0.01vs miR-NC+Lenti-NC group; △P < 0.05, △△P < 0.01 vs miR-34c+Lenti-NC group. 图 7 miRcode、荧光素酶报告实验和RT-PCR法检测各组细胞中miR-34c和LncRNA MALAT1的靶向结合（A）及各组细胞中荧光素酶活性、miR-34c和MALAT1 mRNA表达水平（B，C） Fig. 7 Targeted binding of miR-34c and MALAT1 (A) and activities of luciferase expression levels of miR-34c and LncRNA MALAT1 in cells in various groups(B, C) detected by miRcode, luciferase report experiment and RT-PCR methods

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Lane 1: miR-NC+Lenti-NC; Lane 2: miR-34c +Lenti-NC group; Lane 3: miR-34c+Lenti-MALAT1 group. *P < 0.01 vs miR-NC+Lenti-NC group. 图 8 Western blotting法检测共转染组ADSCs中Runx2、OPN和OCN蛋白表达电泳图（A）和直条图（B） Fig. 8 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of Runx2, OPN and OCN proteins in ADSCs in co-transfection groups detected by Western blotting method

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图 9 ALP和ARS染色检测共转染组ADSCs中ALP活性和钙盐沉积 Fig. 9 ALP activities and calcium salt deposition in ADSCs in co-transfection groups detected by ALP and ARS staining

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*P < 0.05, **P < 0.01 vs miR-NC+Lenti-NC group. 图 10 共转染组ADSCs中ALP和ARS水平 Fig. 10 Levels of ALP and ARS in ADSCs in co-transfection groups

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miR-34c与SATB2结合位点见图 11A。荧光素酶报告实验结果显示：与miR-NC组比较，miR-34c转染后SATB2-WT组荧光素酶活性明显降低（P < 0.01），SATB2-MUT组荧光素酶活性差异无统计学意义（P > 0.05），见图 11B；与miR-NC+Lenti-NC组比较，miR-NC+Lenti-SATB2组ADSCs中SATB2 mRNA表达水平明显升高（P < 0.01），见图 11C；Runx2、OPN和OCN蛋白表达水平明显升高（P < 0.01），见图 12；ALP和ARS水平明显升高（P < 0.01），见图 13（插页三）和图 14；miR-34c+Lenti-SATB2组LncRNA MALAT1表达水平明显降低（P < 0.05），miR-34c表达水平明显升高（P < 0.01），见图 11C；SATB2、Runx2、OPN和OCN蛋白表达水平及ALP和ARS水平差异无统计学意义（P > 0.05）。

*P < 0.01 vs miR-NC group; △P < 0.05, △△P < 0.01 vs Lenti-NC + miR-NC group. 图 11 miR-34c与SATB2结合位点和靶向结合(A)及各组细胞中LncRNA MALAT1、miR-34c和SATB2 mRNA表达水平(B, C) Fig. 11 Binding sites of miR-34c and SATB2 and targeted binding (A) and expression levels of LncRNA MALAT1, miR-34c and SATB2 mRNA in cells in various groups(B, C)

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Lane 1: miR-NC+Lenti-NC group; Lane 2: miR-NC+ Lenti-SATB2 group; Lane 3: miR-34c+ Lenti-SATB2 group.*P < 0.01 vs miR-NC+Lenti-NC group. 图 12 Western blotting法检测各组ADSCs中Runx2、OPN和OCN蛋白表达电泳图（A）和直条图（B） Fig. 12 Electrophoregram (A) and histogram (B) of expressions of Runx2, OPN and OCN proteins in ADSCs in various groups detected by Western blotting method

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图 13 ALP和ARS染色检测ADSCs中ALP活性和钙盐沉积 Fig. 13 ALP activities and calcium salt deposition in ADSCs detected by ALP and ARS staining

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*P < 0.01 vs miR-NC+Lenti-NC group. 图 14 各组ADSCs中ALP和ARS水平 Fig. 14 Levels of ALP and ARS in ADSCs in various groups

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ADSCs是位于脂肪组织中的再生细胞，具有多向分化潜能^[11]。ADSCs可通过脂肪细胞置换促进组织新陈代谢和血管生成^[12]。BMSCs是骨再生的细胞来源，最近研究^[13]表明：BMSCs的增殖能力和成骨分化能力随年龄和骨质疏松程度的增加而降低，而ADSCs在老年和骨质疏松情况下成骨分化能力不变。因此，ADSCs成骨分化机制受到越来越多的关注。LncRNAs是一种转录本长度超过200nt的非编码RNA，参与多种生物学过程，包括表观遗传调控、RNA衰变、细胞分化和转录^[14]。研究^[15]表明：LncRNA在调节骨骼系统相关的生物学活性方面（骨质疏松症和骨关节炎）具有重要作用。LncRNA MALAT1通过调节miR-214/ATF4轴促进成骨分化^[16]。

研究^[17]表明：LncRNA在成骨-成脂谱系中起表观遗传调控作用。LncRNA MIAT1促进ADSCs的成骨分化并逆转炎症的不良反应^[18]。本研究结果显示：在ADSCs成骨分化过程中，MALAT1的表达水平升高，MALAT1正向调控ADSCs成骨分化，这与之前的研究结果一致。研究^[19]表明：miRNA参与调节成骨细胞和破骨细胞分化过程，如miR-221-5p通过靶向smad3抑制BMSCs成骨分化；miRNA-429通过靶向SCD-1抑制氧化应激下人BMSCs的成骨分化^[20]。lncRNA和miRNA间的相互作用参与成骨分化过程，GAO等^[21]研究表明：骨质疏松患者的BMSCs中MALAT1表达水平明显降低，成骨诱导BMSCs后MALAT1表达水平升高。敲除MALAT1则抑制BMSCs的成骨分化，MALAT1通过靶向miR-143促进BMSCs的成骨分化；lncRNA TUG1通过使miR-204-5p海绵化而促进成骨细胞的分化，从而导致Runx2表达上调^[22]。LncRNA MEG3通过靶向miR-133a-3p抑制BMSCs的成骨分化^[23]。本研究结果显示：在ADSCs成骨分化过程中，miR-34c与MALAT1间存在相互调控作用，MALAT1通过靶向抑制miR-34c的表达促进ADSCs成骨分化。

SATB2是成骨细胞分化的特异性免疫组织化学生物标记物，对骨和软组织肿瘤发挥重要作用^[24]。研究^[25]表明：许多特异性miRNAs通过转化生长因子β（TGF-β）/骨形态发生蛋白（BMP）信号途径参与SATB2诱导的早期成骨分化。miR-34b/c靶向调控SATB2^[26-27]。miR-383通过靶向SATB2负调控大鼠BMSCs的成骨细胞分化^[28]。本研究结果显示：SATB2可促进ADSCs成骨分化，miR-34c通过靶向SATB2负调控ADSCs成骨分化。

综上所述，LncRNA MALAT1通过microRNA-34c/SATB2轴促进ADSCs的成骨分化。本研究结果为探究lncRNA调控ADSCs成骨分化的机制和骨损伤的治疗提供了新的科学依据。