吉林大学学报(医学版)  2020, Vol. 46 Issue (05): 930-936     DOI: 10.13481/j.1671-587x.20200506

扩展功能

文章信息

刘璐瑶, 张雯雯, 曹娟, 李玮柏, 孙宏晨, 李波
LIU Luyao, ZHANG Wenwen, CAO Juan, LI Weibo, SUN Hongchen, LI Bo
姜黄素对肿瘤相关巨噬细胞分泌细胞因子基因表达的影响
Effect of curcumin on gene expressions of cytokines secreted by tumor-associated macrophages
吉林大学学报(医学版), 2020, 46(05): 930-936
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2020, 46(05): 930-936
10.13481/j.1671-587x.20200506

文章历史

收稿日期: 2020-02-17
引用本文 0
刘璐瑶, 张雯雯, 曹娟, 李玮柏, 孙宏晨, 李波. 姜黄素对肿瘤相关巨噬细胞分泌细胞因子基因表达的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2020, 46(05): 930-936.
LIU Luyao, ZHANG Wenwen, CAO Juan, LI Weibo, SUN Hongchen, LI Bo. Effect of curcumin on gene expressions of cytokines secreted by tumor-associated macrophages[J]. Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2020, 46(05): 930-936.
姜黄素对肿瘤相关巨噬细胞分泌细胞因子基因表达的影响
刘璐瑶1 , 张雯雯1 , 曹娟1 , 李玮柏1 , 孙宏晨1,2 , 李波1,2     
1. 吉林大学口腔医院实验教学中心, 吉林长春 130021;
2. 中国医科大学口腔医学院·附属口腔医院辽宁省口腔疾病重点实验室, 辽宁 沈阳 110002
收稿日期: 2020-02-17
基金项目: 国家自然科学基金(51408205)
作者简介: 刘璐瑶(1994－)，女，吉林省榆树市人，在读医学硕士，主要从事口腔肿瘤发病机制及治疗方面的研究;
李波，副教授，硕士研究生导师(Tel：0431-85579563，E-mail：lbo@jlu.edu.cn)。
[摘要]: 目的 ：研究姜黄素对口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞(Cal27细胞)上清液诱导的肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)分泌细胞因子基因表达的影响，阐明姜黄素抗OSCC的作用机制。方法 ：将Raw264.7细胞随机分为对照组及不同浓度(1.25、2.50、5.00、10.00、20.00和40.00μmol·L-1)姜黄素组，各组细胞加入Cal27细胞上清液共同孵育48 h，CCK-8法检测细胞活性。将Raw264.7细胞随机分为对照组及不同浓度(5、10和20μmol· L-1)姜黄素组，各组细胞加入Cal27细胞上清液共同孵育36和48 h后，采用Real-time PCR法检测各组细胞中白细胞介素12(IL-12)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素10(IL-10)mRNA表达水平；Cal27细胞上清液孵育Raw264.7细胞48 h后，姜黄素组加入不同浓度(5、10和20μmol·L-1)姜黄素干预48 h，采用Real-time PCR法检测各组细胞中IL-12、iNOS、TNF-α、IL-10和精氨酸酶1(Arg-1)mRNA表达水平。结果 ：与对照组比较，40 μmol·L-1姜黄素组Raw264.7细胞活性明显降低(P < 0.01)。不同浓度姜黄素与Cal27细胞上清液共同孵育Raw264.7细胞36 h，与对照组比较，20 μmol·L-1姜黄素组Raw264.7细胞中IL-12 mRNA表达水平明显升高(P < 0.01)，10和20μmol·L-1姜黄素组Raw264.7细胞中iNOS和TNF-α mRNA表达水平明显降低(P < 0.05或P < 0.01)，20μmol·L-1组Raw264.7细胞中IL-10 mRNA表达水平降低(P < 0.01)；不同浓度姜黄素与Cal27细胞上清液共同孵育Raw264.7细胞48 h，与对照组比较，5和20 μmol·L-1姜黄素组Raw264.7细胞中IL-12 mRNA表达水平明显升高(P < 0.01)，5和20μmol·L-1姜黄素组Raw264.7细胞中iNOS、TNF-α和IL-10 mRNA表达水平均明显降低(P < 0.01)。Cal27细胞上清液孵育Raw264.7细胞48 h后，采用不同浓度姜黄素进行干预，与对照组比较，10和20 μmol·L-1姜黄素组Raw264.7细胞中IL-12 mRNA表达水平升高(P < 0.01)，不同浓度姜黄素组Raw264.7细胞中iNOS、TNF-α和Arg-1 mRNA表达水平降低(P < 0.05或P < 0.01)，20μmol·L-1姜黄素组Raw264.7细胞中IL-10 mRNA表达水平均明显降低(P < 0.01)。结论 ：姜黄素可以在诱导TAMs的不同阶段调节TAMs分泌细胞因子IL-12、iNOS、TNF-α、IL-10和Arg-1 mRNA表达水平。
关键词: 姜黄素    肿瘤相关巨噬细胞    细胞因子    口腔鳞状细胞癌    
Effect of curcumin on gene expressions of cytokines secreted by tumor-associated macrophages
LIU Luyao1 , ZHANG Wenwen1 , CAO Juan1 , LI Weibo1 , SUN Hongchen1,2 , LI Bo1,2     
1. Experimental Teaching Center, Stomatology Hospital, Jilin University, Changchun, 130021, China;
2. Affiliated Stomatology Hospital, School of Stomatology, China Medical University, Liaoning Key Laboratory of Oral Diseases, Shenyang 110002, China
[ABSTRACT]: Objective To investigate the effect of curcumin on the gene expressions of cytokines secreted by tumor-associated macrophages (TAMs) induced by the supernatants of the oral squamous cell carcinoma (OSCC) cells (Cal27 cells), and to clarify the mechanism of curcumin's anti-OSCC effect. Methods The Raw264.7 cells were randomly divided into control group and different concentrations (1.25, 2.50, 5.00, 10.00, 20.00 and 40.00 μmol·L-1) of curcumin groups. The cells from each group were added with Cal27 cell supernatants and incubated for 48 h, and the cell activities were detected by CCK-8 assay. The Raw264.7 cells were randomly divided into control group and different concentrations (5, 10 and 20 μmol·L-1) of curcumin groups. The cells from each group were added with Cal27 cell supernatants and incubated for 36 and 48 h, and Real-time PCR method was used to detect the mRNA expression levels of interleukin-12 (IL-12), inducible nitric oxide synthase (iNOS), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-10 (IL-10) in the cells in various groups. After the Raw264.7 cells were incubated with Cal27 cell supernatants for 48 h, the cells in curcumin groups were treated with different concentrations (5, 10 and 20 μmol·L-1) of curcumin for 48 h, and Real-time PCR curcumin method was used to detect the mRNA expression levels of IL-12, iNOS, TNF-α, IL-10 and Arginase 1 (Arg-1) in the cells in various groups. Results up was significantly reduced (P < 0.01). After the Raw264.7 cells were incubated with different concentrations of curcumin and Cal27 cell supernatants for 36 h, compared with control group, the IL-12 mRNA expression level in 20 μmol·L-1 curcumin group was increased (P < 0.01); the iNOS and TNF-α mRNA expression levels in the Raw264.7 cells in 10 and 20 μmol·L-1 groups were significantly decreased (P < 0.05 or P < 0.01); the IL-10 mRNA expression level in 20 μmol·L-1 group was decreased (P < 0.01). After the Raw264.7 cells were incubated with different concentrations of curcumin and Cal27 cell supernatants for 48 h, compared with control group, the IL-12 mRNA expression levels in the Raw264.7 cells in 5 and 20 μmol·L-1 groups were increased (P < 0.01); the iNOS TNF-α and IL-10 mRNA expression levels in 5 and 20 μmol·L-1 groups were decreased (P < 0.01). After the Raw264.7 cells were incubated with Cal27 cell supernatants for 48 h, and intervented with different concentrations of curcumin, compared with control group, the IL-12 mRNA expression levels in 10 and 20 μmol·L-1 curcumin groups were increased (P < 0.01); the iNOS, TNF-α and Arg-1 mRNA expression levels in the Raw264.7 cells in different concentrations of curcumin groups were decreased (P < 0.05 or P < 0.01); the IL-10 mRNA expression level in the Raw264.7 cells in 20 μmol·L-1 curcumin group was significantly reduced (P < 0.01). Conclusion Curcumin can regulate the mRNA expression levels of cytokines IL-12, iNOS, TNF-α, IL-10 and Arg-1 secreted by TAMs at different stages of TAMs induction.
KEYWORDS: curcumin    tumor-associated macrophages    cytokine    oral squamous cell carcinoma    

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，是一种极具侵袭性的恶性肿瘤，早期OSCC患者5年生存率为55%~60%，晚期OSCC患者5年生存率为30%~40%[1]。OSCC的治疗，在其非特异性、非选择性和毒性方面仍存在巨大的挑战，多数患者在手术、化疗及放疗过程中出现严重不良反应，且后期易复发和转移[2]。OSCC的形成过程中有活化的巨噬细胞参与，浸润巨噬细胞数量是OSCC进展和预后的预测因子[3]。巨噬细胞在趋化因子的作用下浸润到肿瘤周围，在肿瘤微环境的作用下形成肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAMs)。TAMs通过分泌多种因子和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)等与肿瘤细胞进行交互作用，进而在肿瘤增殖、侵袭、转移和血管生成等过程中发挥作用。TAMs分泌细胞因子的表达变化与其表型有密切关联，可以用于TAMs表型转化和对M2型TAMs再教育研究[4-5]。姜黄素是姜黄的主要活性成分，是一种从天然植物姜黄根茎中提取出的多酚化合物。姜黄素具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等多种药理作用[6]。姜黄素对OSCC的增殖、侵袭、转移和血管生成等有明显的抑制作用。研究[7]表明：姜黄素能通过抑制表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)和EGFR下游信号分子蛋白激酶B(Akt)，细胞外信号调节蛋白激酶(ERK1/2)和信号转录及转录激活因子3(STAT3)的磷酸化抑制OSCC的增殖和侵袭；可以通过减少MMP2和MMP9及调节p53-E-钙黏蛋白途径抑制OSCC的侵袭和上皮-间充质转化[8]；还能通过抑制辐射诱导的核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)活性协同增强人OSCC的放射敏感性[9]。姜黄素可以干预TAMs分泌细胞因子的表达[10-11]。在白血病中，姜黄素通过Toll样受体4(TLR4)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/NF-κB通路降低TAMs肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)和白细胞介素12B(interleukin-12B，IL-12B)的表达[10]；姜黄素能够促进肿瘤宿主巨噬细胞产生白细胞介素1(interleukin-1，IL-1)、IL-6和TNF-α，抑制白细胞介素10(interleukin-10，IL-10)和转化生长因子β(transforming growth factor，TGF-β)的生成[11]。但是，姜黄素对OSCC中TAMs分泌细胞因子的影响目前尚未见相关报道。因此，本文作者推测：姜黄素可能通过干预OSCC中TAMs分泌细胞因子的表达，进而抑制OSCC的进展。本研究旨在通过探讨姜黄素对OSCC肿瘤细胞上清液诱导的TAMs分泌细胞因子基因表达的影响，进一步阐明姜黄素抗OSCC作用机制，为OSCC的治疗提供新的实验依据以及潜在的治疗策略。

1 材料与方法 1.1 细胞、主要试剂和仪器

人OSCC Cal27细胞以及Raw264.7巨噬细胞购自中国典型培养物宝藏中心(China Center for Type Culture Collection，CCTCC)，由吉林大学口腔医院实验教学中心进行传代培养。DMEM-高糖培养基(货号C11995500BT，美国Gibco公司)，胎牛血清(货号04-001-1A)和青链霉素双抗(货号Hyc-SV30010)购自以色列BI公司，姜黄素(货号C7727-500MG，美国Sigma公司)，CCK-8试剂盒(K1018-5mL，美国APExBIO公司)，总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒和Real-time PCR试剂盒(大连TaKaRa公司)。实时荧光定量PCR仪(美国安捷伦公司)。

1.2 细胞培养

Cal27细胞和Raw264.7细胞均采用含10%胎牛血清、1%青链霉素双抗的DMEM高糖培养基在37℃、5% CO2且饱和湿度的培养箱中培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.3 肿瘤细胞上清液的收集及姜黄素和 Cal27细胞上清混合液的制备

取对数生长期Cal27细胞，接种到75 cm2细胞培养瓶中，待细胞生长至约为80%融合率时换成10 mL新鲜完全培养基继续培养，24 h后收集上清液，500 g离心5 min，弃掉沉淀收集上清，将上清液与新鲜完全培养基按7:3比例配制。将姜黄素溶于配置后的Cal27肿瘤细胞上清液中形成不同浓度的姜黄素和Cal27细胞上清混合液。

1.4 CCK-8法检测细胞活性

取对数生长期Raw264.7细胞，重悬成单细胞悬液，按每孔100 μL、2 000个细胞数接种于96孔细胞培养板内，随机分为对照组和实验组，每组设5个复孔，用Cal27细胞上清液孵育Raw264.7细胞，实验组用不同浓度(1.25、2.50、5.00、10.00、20.00和40.00 μmol·L-1)姜黄素进行干预。待细胞贴壁状态稳定后，弃掉原培养基，按实验分组每孔加入100 μL相应溶液，在培养箱中孵育48 h后，每孔中加入10 μL CCK-8溶液，继续孵育4 h，于酶标仪450 nm处检测各孔吸光度(A)值。根据各孔A值计算细胞存活率。细胞存活率＝(实验孔A值－空白孔A值)/(对照孔A值－空白孔A值)。

1.5 Real-time PCR法检测细胞中TAMs分泌细胞因子mRNA表达水平

取对数生长期Raw264.7细胞，重悬成单细胞悬液接种于6孔细胞培养板内，随机分为对照组和实验组，每组设3个复孔，用Cal27细胞上清液孵育Raw264.7细胞，实验组用不同浓度(5、10和20 μmol·L-1)姜黄素进行干预。根据试剂盒说明书提取总mRNA，测定mRNA的浓度，按照逆转录试剂盒操作步骤将各组mRNA反转录为cDNA。按照Real-time PCR试剂盒步骤进行实验。各目的基因mRNA相对表达水平采用2-ΔΔCT法计算。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列：β-actin，上游引物5'-GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG-3'，下游引物5'-ATGCCACAGGATTCCATACC-3'；IL-10，上游引物5'-CTGCTATGCTGCCTGCTCT-TACTG-3'，下游引物5'-ATGTGGCTCTGGCCGA-CTGG-3'；IL-12，上游引物5'-ACGAGAGTTGCCT-GGCTACTAGAG-3'，下游引物5'-TCTGAAGTGC-TGCGTTGATGGC-3'；TNF-α，上游引物5'-CTCATGCACCACCATCAAGGACTC-3'，下游引物5'-AGACAGAGGCAACCTGACCACTC-3'；Arg-1，上游引物5'-TGCTCACACTGACATCAAC-ACTCC-3'，下游引物5'-GGTCTACGTCTCGCA-AGCCAATG-3'；iNOS，上游引物5'-TGCCACGG-ACGAGACGGATAG-3'，下游引物5'-CTCTTCAA- GCACCTCCAGGAACG-3'。

1.6 统计学分析

采用Graphpad Prism 5.0统计软件进行统计学分析。各组Raw264.7细胞存活率以及Raw264.7细胞分泌的IL-12、iNOS、TNF-α、IL-10和Arg-1mRNA表达水平均符合正态分布，以x±s表示。所有实验数据均是重复3次以上的结果，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组Raw264.7细胞活性

与对照组比较，1.25、2.50、5.00、10.00和20.00 μmol·L-1姜黄素组Raw264.7细胞活性均有不同程度降低，但差异无统计学意义(P>0.05)；40 μmol ·L-1姜黄素组Raw264.7细胞活性明显降低(P < 0.01)。因此后续实验将选取不加姜黄素组作为对照组，5、10和20 μmol·L-1姜黄素组作为实验组进行干预。见表 1。

表 1 CCK-8法检测各组Raw264.7细胞活性 Tab. 1 Activities of Raw264.7 cells in various groups detected by CCK-8 assay 
(n=5, x±s, η/%)
Group Cell activity (48 h)
Control 100.00±2.24
Curcumin(μmol·L-1)
1.25 89.56±2.23
2.5 87.60±1.81
5 90.63±3.03
10 92.85±3.97
20 90.05±5.01
40 58.53±2.06*
*P < 0.01 vs control group.
表选项
2.2 TAMs诱导过程中各组Raw264.7细胞中IL-12、iNOS和TNF-α mRNA表达水平

不同浓度姜黄素和Cal27细胞上清液共同孵育Raw264.7细胞36 h，与对照组比较，5 μmol·L-1姜黄素组Raw264.7细胞中IL-12 mRNA表达水平差异无统计学意义(P > 0.05)，10 μmol·L-1姜黄素组Raw264.7细胞中IL-12 mRNA表达水平有上升趋势，但差异也无统计学意义(P>0.05)，20 μmol·L-1姜黄素组Raw264.7细胞中IL-12 mRNA表达水平明显升高(P < 0.01)；iNOS mRNA表达水平均有不同程度降低，10和20 μmol·L-1姜黄素组Raw264.7细胞中iNOS mRNA表达水平明显降低(P < 0.05)；不同浓度姜黄素组Raw264.7细胞中TNF-α mRNA表达水平均有下降趋势，10和20 μmol ·L-1组TNF-α mRNA表达水平明显降低(P < 0.01)。不同浓度姜黄素和Cal27细胞上清液共同孵育Raw264.7细胞48 h，与对照组比较，不同浓度姜黄素组Raw264.7细胞中IL-12 mRNA表达水平均有不同程度升高，5和20 μmol·L-1姜黄素组Raw264.7细胞中IL-12 mRNA表达水平升高(P < 0.01)；不同浓度姜黄素组Raw264.7细胞中iNOS mRNA表达水平均有下降趋势，其中5和20 μmol·L-1姜黄素组Raw264.7细胞中iNOS mRNA表达水平降低(P < 0.01)；不同浓度姜黄素组Raw264.7细胞中TNF-α mRNA表达水平均降低(P < 0.01)。见表 2。

表 2 各组Raw264.7细胞中IL-12、iNOS和TNF-α mRNA表达水平 Tab. 2 Expression levels of IL-12, iNOS and TNF-α mRNA in Raw264. 7 cells in various groups
(n=3, x±s)
Group IL-12 iNOS TNF-α
(t/h) 36 48 36 48 36 48
Control 1.00±0.02 1.00±0.04 1.00±0.02 1.00±0.01 1.00±0.02 1.00±0.04
Curcumin(μmol·L-1)
5 1.00±0.02 1.90±0.06** 0.77±0.12 0.60±0.05** 0.89±0.02 0.63±0.03**
10 1.72±0.31 1.45±0.01 0.64±0.05* 0.90±0.02 0.68±0.04** 0.82±0.01**
20 5.49±0.55** 2.14±0.24** 0.63±0.03* 0.72±0.01** 0.46±0.02** 0.67±0.01**
 *P < 0.05，**P < 0.01 vs control group.
表选项
2.3 TAMs诱导过程中各组Raw264.7细胞中IL-10 mRNA表达水平

不同浓度姜黄素和Cal27细胞上清液共同孵育Raw264.7细胞36 h，与对照组比较，20 μmol ·L-1组姜黄素Raw264.7细胞中IL-10 mRNA表达水平明显降低(P < 0.01)。不同浓度姜黄素和Cal27细胞上清液共同孵育Raw264.7细胞48 h，与对照组比较，不同浓度姜黄素组Raw264.7细胞中IL-10 mRNA表达水平均明显降低(P < 0.01)。见表 3。

表 3 T各组Raw264.7细胞中IL-10 mRNA表达水平 Tab. 3 Expression levels of IL-10 mRNA in Raw264. 7 cells in various groups 
(n=3, x±s)
Group IL-10
(t/h) 36 48
Control 1.00±0.01 1.00±0.01
Curcumin(μmol·L-1)
5 0.96±0.01 0.68±0.01*
10 1.16±0.02 0.74±0.02*
20 0.64±0.10* 0.60±0.01*
 **P < 0.01 vs control group.
表选项
2.4 TAMs诱导48 h后加入姜黄素干预时各组Raw264.7细胞中IL-12、iNOS、TNF-α、IL-10和Agr-1 mRNA表达水平

Cal27细胞上清液孵育Raw264.7细胞48 h后，采用不同浓度的姜黄素进行干预，与对照组比较，10和20 μmol·L-1姜黄素组Raw264.7细胞中IL-12 mRNA表达水平明显升高(P < 0.01)，iNOS mRNA表达水平均明显降低(P < 0.01)；5 μmol·L-1姜黄素组Raw264.7细胞中TNF-α mRNA表达水平降低(P < 0.05)，10和20 μmol·L-1姜黄素组Raw264.7细胞中TNF-α mRNA表达水平明显降低(P < 0.01)。与对照组比较，10和20 μmol·L-1姜黄素组Raw264.7细胞中IL-10 mRNA表达水平明显降低(P < 0.01)，5、10和20 μmol·L-1姜黄素组Raw264.7细胞中Arg-1 mRNA表达水平均明显降低(P < 0.01)。见表 4。

表 4 TAMs诱导48 h后姜黄素作用下各组Raw264.7细胞中IL-12、iNOS、TNF-α、IL-10和Agr-1 mRNA表达水平 Tab. 4 Expression levels of IL-12, iNOS, TNF-α IL-10, and Arg-1 mRNA in Raw264.7 cells in various groups after TAMs induction for 48 h followed by curcumin treatment  
(n=3, x±s)
Group IL-12 iNOS TNF-α IL-10 Arg-1
Control 1.00±0.05 1.00±0.04 1.00±0.01 1.00±0.02 1.00±0.02
Curcumin(μmol·L-1)
5 0.93±0.09 0.73±0.04** 0.84±0.04* 0.92±0.03 0.24±0.01*
10 2.95±0.25** 0.68±0.01** 0.59±0.01** 0.75±0.05 0.09±0.01*
20 3.88±0.11** 0.23±0.01** 0.71±0.04** 0.26±0.01* 0.13±0.03*
 *P < 0.05，**P < 0.01 vs control group.
表选项
3 讨论

本研究选用Cal27和Raw264.7这2种细胞系，采用Cal27细胞上清液孵育Raw264.7诱导形成TAMs；在TAMs诱导过程中以及诱导48 h后使用姜黄素进行干预，观察姜黄素对TAMs分泌细胞因子基因表达的影响。

目前将巨噬细胞诱导成TAMs的方式主要有2种：一种是直接使用脂多糖(LPS)/γ-干扰素(IFN-γ)或白细胞介素4(IL-4)/白细胞介素13(IL-13)将巨噬细胞诱导成M1或M2表型的TAMs，如IL-4/ IL-13刺激Raw264.7细胞诱导成M2型TAMs，经羧化多壁碳纳米管处理后M2型TAMs向M1表型转化[12]；IL-4处理小鼠巨噬细胞诱导成M2表型TAMs，LPS诱导形成M1表型TAMs，6-姜醇通过改变TAMs极化状态，以防止氨基甲酸酯诱导的肺癌发生[13]；另一种是使用肿瘤上清液诱导巨噬细胞形成TAMs，如佛波酯处理的单核细胞系(THP-1)细胞与人A549细胞培养上清液共培养48 h诱导形成M2型TAMs，观察SPP1影响TAMs极化并促进肺腺癌的免疫逃逸[14]；Raw264.7巨噬细胞与4T1细胞上清液共孵育72 h后成功诱导成M2型TAMs，观察肿瘤来源的透明质酸对巨噬细胞免疫抑制作用的影响[15]。使用LPS/ IFN-γ或IL-4/ IL-13诱导巨噬细胞极化不仅应用于肿瘤，还应用于炎症相关研究，但无法模拟肿瘤微环境，同时也无法体现不同肿瘤之间的差异性；使用不同肿瘤细胞上清液诱导巨噬细胞形成TAMs，能够真实还原巨噬细胞在不同肿瘤微环境中形成TAMs的过程。本研究采用Cal27上清液诱导TAMs，可以更好地模拟OSCC肿瘤微环境中TAMs的形成过程，确保实验数据翔实可靠。研究姜黄素对TAMs分泌细胞因子基因表达的影响，有助于进一步阐明姜黄素抗OSCC的作用机制。

TAMs分泌的细胞因子，在肿瘤的进展中发挥着重要作用。在黑色素瘤中，Batf2通过上调TAMs分泌的IL-12发挥其抗肿瘤的作用[16]；紫杉醇可以诱导TAMs重新生成IL-12，纠正肿瘤诱导的免疫功能障碍，进而对抗纤维肉瘤[17]；IL-12还具有诱导肿瘤细胞自噬、抑制肿瘤细胞转移及血管生成等作用[18]。TAMs分泌的TNF-α具有促进肿瘤生长及转移的作用，是多种癌症发生、增殖、转移和血管生成过程中的关键因子[19-21]。iNOS与肿瘤的分化、转移及预后有密切关联[21]。在肿瘤微环境中，IL-10表达水平升高可以激活STAT3通路进而促进肝癌的浸润和转移[22]；IL-10可以促进乳腺癌的免疫逃逸[23]；IL-10通过产生TNF家族细胞活化因子BAFF促进淋巴瘤的存活及发展[24]。Arg-1在多种癌症中呈阳性表达，具有抑制免疫反应促进肿瘤生长的作用[25]。

本研究结果显示：姜黄素能上调TAMs分泌细胞因子IL-12的表达水平，下调TNF-α、iNOS、IL-10和Arg-1表达水平。IL-12被称为重要的抗肿瘤细胞因子，通过不同的机制抑制肿瘤的发生发展[16-17]。姜黄素可能通过上调TAMs分泌细胞因子IL-12表达进而抑制OSCC的进展。在OSCC发展过程中，阻断TNF-α的生成可抑制肿瘤的血管生成及生长[19]；TNF-α诱导的miR-450a介导的TMEM182表达，以促进OSCC的运动[20]。姜黄素可能通过下调TNF-α的表达进而抑制OSCC的血管生成、生长及侵袭。iNOS对OSCC的发生发展起重要作用，可能通过下调iNOS的表达进而与OSCC的分化、淋巴结转移及预后有密切关联[21]。CD163+/CD204+ M2型TAMs通过产生IL-10和程序死亡配体1(PD-L1)作用于T细胞，促进OSCC的侵袭和转移[26]。姜黄素可能通过下调IL-10表达水平抑制OSCC的侵袭和转移。Arg-1具有抑制免疫反应促进肿瘤生长的作用[25]，还可能通过下调Arg-1的表达抑制OSCC生长。

研究[4, 27]表明：中药可以通过调控TAMs分泌细胞因子的表达干预TAMs的表型变化。中药消水汤上调M2型TAMs IL-12的表达水平，下调IL-10的表达水平，促进M2型TAMs向M1表型极化[4]；三七通过上调M1型因子IL-1β、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、TNF-α和iNOS表达水平，下调M2型因子IL-10和YM-1的表达水平，激活巨噬细胞向M1表型极化抑制肿瘤生长[27]。与上述研究结果不同，本研究中姜黄素下调TNF-α和iNOS的表达水平。姜黄素可以下调小鼠巨噬细胞中TNF-α和IL-1β的产生并抑制NF-κB的活化，而TNF-α和IL-1β是巨噬细胞中iNOS基因表达的关键，NF-κB对iNOS的转录至关重要[28]；姜黄素是iNOS激活的抑制剂，可以抑制iNOS蛋白表达，姜黄素还降低肺泡巨噬细胞中TNF-α及NO的合成[29]。姜黄素可能通过上述途径下调TNF-α和iNOS的基因表达。

本研究中，TAMs分泌的IL-12、IL-10和Arg-1表达水平的变化与TAMs表型的转化有密切关联。在TAMs诱导过程中，姜黄素上调M1型细胞因子IL-12表达水平的同时，下调M2型细胞因子IL-10的表达水平，表明姜黄素可能延缓了TAMs由M1型向M2型转化的过程；TAMs诱导48 h后使用姜黄素进行干预，M1型细胞因子IL-12表达水平上调，M2型细胞因子IL-10和Arg-1表达水平下调，表明姜黄素可能对M2型TAMs再教育，使其由M2型向M1型转变。上述结果表明：姜黄素可能从延长M1型TAMs持续时间和对M2型TAMs再教育2个途径干预TAMs表型变化，最大限度解除免疫限制，进而对抗OSCC。

综上所述，姜黄素可以调节TAMs分泌细胞因子的基因表达，其可能通过干预IL-12、TNF-α、iNOS、IL-10和Arg-1在OSCC中的作用以及TAMs的表型变化，进而发挥其抗OSCC作用。本研究有助于进一步阐明姜黄素抗OSCC的作用机制，为OSCC的治疗提供新的实验依据以及潜在的治疗策略。

参考文献
[1]
PEIXOTO T S, GOMES M C, CASTRO GOMES D Q, et al. Analysis of survival rates and prognostic factors among patients with oral squamous cell carcinoma[J]. J Public Health-Heidelberg, 2017, 25(4): 433-441. DOI:10.1007/s10389-017-0794-3
[2]
NARUSE T, YANAMOTO S, MATSUSHITA Y, et al. Cetuximab for the treatment of locally advanced and recurrent/metastatic oral cancer: An investigation of distant metastasis[J]. Mol Clin Oncol, 2016, 5(2): 246-252. DOI:10.3892/mco.2016.928
[3]
CHIU K C, LEE C H, LIU S Y, et al. Polarization of tumor-associated macrophages and Gas6/Axl signaling in oral squamous cell carcinoma[J]. Oral Oncol, 2015, 51(7): 683-689. DOI:10.1016/j.oraloncology.2015.04.004
[4]
JIN Z C, SHEN C F, ZHANG H D, et al. Chinese medicine Xiaoshui decoction inhibits malignant pleural effusion in mice and mediates tumor-associated macrophage polarization by activating autophagy[J]. J Ethnopharmacol, 2020, 249: 112412. DOI:10.1016/j.jep.2019.112412
[5]
KOWAL J, KORNETE M, JOYCE J A. Re-education of macrophages as a therapeutic strategy in cancer[J]. Immunotherapy, 2019, 11(8): 677-689. DOI:10.2217/imt-2018-0156
[6]
ZHANG Q, QIAO H W, WU D D, et al. Curcumin potentiates the galbanic acid-induced anti-tumor effect in non-small cell lung cancer cells through inhibiting Akt/mTOR signaling pathway[J]. Life Sci, 2019, 239: 117044. DOI:10.1016/j.lfs.2019.117044
[7]
ZHEN L, FAN D S, YI X H, et al. Curcumin inhibits oral squamous cell carcinoma proliferation and invasion via EGFR signaling pathways[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2014, 7(10): 6438-6446.
[8]
LEE A Y, FAN C C, CHEN Y A, et al. Curcumin inhibits invasiveness and epithelial-mesenchymal transition in oral squamous cell carcinoma through reducing matrix metalloproteinase 2, 9 and modulating p53-E-cadherin pathway[J]. Integr Cancer Ther, 2015, 14(5): 484-490. DOI:10.1177/1534735415588930
[9]
CHIANG I T, LIU Y C, HSU F T, et al. Curcumin synergistically enhances the radiosensitivity of human oral squamous cell carcinoma via suppression of radiation-induced NF-κB activity[J]. Oncol Rep, 2014, 31(4): 1729-1737. DOI:10.3892/or.2014.3009
[10]
ZHOU Y Y, ZHANG T T, WANG X F, et al. Curcumin modulates macrophage polarization through the inhibition of the Ttoll-like receptor 4 expression and its signaling pathways[J]. Cell Physiol Biochem, 2015, 36(2): 631-641. DOI:10.1159/000430126
[11]
VISHVAKARMA N K, KUMAR A, KUMAR A, et al. Myelopotentiating effect of curcumin in tumor-bearing host: Role of bone marrow resident macrophages[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2012, 263(1): 111-121. DOI:10.1016/j.taap.2012.06.004
[12]
WU L L, TANG H L, ZHENG H, et al. Multiwalled carbon nanotubes prevent tumor metastasis through switching M2-polarized macrophages to M1 via TLR4 activation[J]. J Biomed Nanotechnol, 2019, 15(1): 138-150. DOI:10.1166/jbn.2019.2661
[13]
YAO J J, DU Z H, LI Z B, et al. 6-Gingerol as an arginase inhibitor prevents urethane- induced lung carcinogenesis by reprogramming tumor supporting M2 macrophages to M1 phenotype+[J]. Food Funct, 2018, 9(9): 4611-4620. DOI:10.1039/C8FO01147H
[14]
ZHANG Y, DU W, CHEN Z, et al. Upregulation of PD-L1 by SPP1 mediates macrophage polarization and facilitates immune escape in lung adenocarcinoma[J]. Exp Cell Res, 2017, 359(2): 449-457. DOI:10.1016/j.yexcr.2017.08.028
[15]
KUANG D M, WU Y, CHEN N N, et al. Tumor-derived hyaluronan induces formation of immunosuppressive macrophages through transient early activation of monocytes[J]. Blood, 2007, 110(2): 587-595. DOI:10.1182/blood-2007-01-068031
[16]
KANEMARU H, YAMANE F, FUKUSHIMA K, et al. Antitumor effect of Batf2 through IL-12 p40 up-regulation in tumor-associated macrophages[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2017, 114(35): E7331-E7340.
[17]
MULLINS D W, BURGER C J, ELGERT K D. Paclitaxel enhances macrophage IL-12 production in tumor-bearing hosts through nitric oxide[J]. J Immunol, 1999, 162(11): 6811-6818.
[18]
LASEK W, ZAGOŻDŻON R, JAKOBISIAK M. Interleukin 12: still a promising candidate for tumor immunotherapy?[J]. Cancer Immunol Immunother, 2014, 63(5): 419-435. DOI:10.1007/s00262-014-1523-1
[19]
YAN T L, WANG M, XU Z, et al. Up-regulation of syncytin-1 contributes to TNF-α-enhanced fusion between OSCC and HUVECs partly via Wnt/β-catenin-dependent pathway[J]. Sci Rep, 2017, 7: 40983. DOI:10.1038/srep40983
[20]
HSING E W, SHIAH S G, PENG H Y, et al. TNF-α-induced miR-450a mediates TMEM182 expression to promote oral squamous cell carcinoma motility[J]. PLoS One, 2019, 14(3): e0213463.
[21]
VARGHESE S S, SUNIL P M, MADHAVAN R N. Expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in oral precancer and oral squamous cell carcinoma: An immunohistochemical study[J]. Cancer Biomark, 2010, 8(3): 155-160.
[22]
CUI C B, FU K W, YANG L, et al. Hypoxia-inducible gene 2 promotes the immune escape of hepatocellular carcinoma from nature killer cells through the interleukin-10-STAT3 signaling pathway[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2019, 38(1): 229. DOI:10.1186/s13046-019-1233-9
[23]
HAMIDULLAH, CHANGKIJA B, KONWAR R. Role of interleukin-10 in breast cancer[J]. Breast Cancer Res Treat, 2012, 133(1): 11-21.
[24]
OGDEN C A, POUND J D, BATTH B K, et al. Enhanced apoptotic cell clearance capacity and B cell survival factor production by IL-10-activated macrophages: implications for Burkitt's lymphoma[J]. J Immunol, 2005, 174(5): 3015-3023. DOI:10.4049/jimmunol.174.5.3015
[25]
MARTINENAITE E, MORTENSEN R E J, HANSEN M, et al. Frequent adaptive immune responses against arginase-1[J]. Oncoimmunology, 2018, 7(3): e1404215.
[26]
KUBOTA K, MORIYAMA M, FURUKAWA S, et al. CD163+ CD204+ tumor-associated macrophages contribute to T cell regulation via interleukin-10 and PD-L1 production in oral squamous cell carcinoma[J]. Sci Rep, 2017, 7(1): 1755. DOI:10.1038/s41598-017-01661-z
[27]
KIM B, KIM E Y, LEE E J, et al. Panax notoginseng inhibits tumor growth through activating macrophage to M1 polarization[J]. Am J Chin Med, 2018, 46(6): 1369-1385. DOI:10.1142/S0192415X18500726
[28]
陈亚利, 欧阳军, 孟晶茜, 等. 姜黄素对高尿酸血症大鼠肾组织中TGF-β1、NF-κB表达的影响[J]. 郑州大学学报(医学版), 2018, 53(3): 360-364.
[29]
ZHANG J W, ZHENG Y L, LUO Y, et al. Curcumin inhibits LPS-induced neuroinflammation by promoting microglial M2 polarization via TREM2/ TLR4/ NF-κB pathways in BV2 cells[J]. Mol Immunol, 2019, 116: 29-37. DOI:10.1016/j.molimm.2019.09.020