宫颈癌患者治疗失败及预后比较差的主要原因为宫颈癌的转移，但其侵袭转移的分子机制尚不十分清楚。外泌体为一种双层膜包裹的小囊泡，在生理和病理条件下由细胞释放到胞外^[1]。研究^[2-3]显示：外泌体携带包括mRNA、DNA、长链非编码RNA(LncRNAs)、微小RNA(microRNAs)、脂质和蛋白等一系列生物活性物质，在恶性肿瘤的侵袭、转移、血管生成和化疗耐药等过程中发挥重要作用。宫颈癌细胞来源外泌体也受到大家关注，易红艳等^[4]通过差速超速离心法分离出宫颈癌Siha细胞外泌体，并发现Siha细胞外泌体可介导癌前细胞Ect1上皮间质转化，从而提高其侵袭能力。但宫颈癌HeLa细胞外泌体对其侵袭迁移的影响及可能机制尚未完全清楚。本文作者通过分离宫颈癌HeLa细胞外泌体，观察其对HeLa细胞迁移、侵袭及Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路的影响，探讨宫颈癌细胞来源的外泌体对宫颈癌细胞的作用和可能机制。

人宫颈癌HeLa细胞(ATCC细胞库)。FKH-26染剂和胰蛋白酶(美国Sigma公司)，RPMI 1640培养基和胎牛血清(美国Hyclone公司)，兔抗人CD63抗体、兔抗人CD81抗体、兔抗人Wnt1抗体、兔抗人β-catenin抗体和兔抗人T细胞因子4(T cell factor 4, TCF4)抗体(美国Abcam公司)。共聚焦显微镜(德国Leica公司)，JEM-1400透射电子显微镜(日本电子公司)，Transwell小室(美国Corning公司)，Matrigel基质胶(美国BD公司)。

将Hyclone胎牛血清100 000 g离心70 min，去除沉淀得到无外泌体胎牛血清。将HeLa细胞用无外泌体的胎牛血清配置的RPMI 1640培养基(含10%胎牛血清)培养。

将对数生长的HeLa细胞用胰蛋白酶消化，用无外泌体的胎牛血清配置的RPMI 1640培养基(含10%胎牛血清)培养48 h，收集HeLa细胞培养上清，500 g离心10 min，再12 000 g离心20 min，取上清液，经0.22 μm孔滤器过滤，过滤后100 000 g离心2 h，用磷酸盐缓冲液(PBS)液重悬沉淀，100 000 g离心2 h，沉淀用PBS液重悬即为HeLa细胞外泌体，保存备用。

将上述获得的沉淀用PBS(含2%多聚甲醛)重悬，吸取适量重悬液滴加到电镜用铜网上，干燥30 min，PBS液清洗，加入1%戊二醛固定5 min，蒸馏水冲洗，用0.4%醋酸双氧铀染色5 min，醋酸双氧铀和甲基纤维素混合物染色并包被10 min，晾10 min，透射电镜下拍照并观察外泌体形态表现。

取20 μL重悬的上述外泌体，加入蛋白裂解液10 μL，冰上裂解30 min，12 000 g离心20 min，收集上清液即为外泌体蛋白。取80 μg外泌体蛋白经电泳2 h，半干法转膜，脱脂奶粉封闭1 h，加入相应一抗(兔抗人CD63抗体、兔抗人CD81抗体，稀释比例1:1000)，过夜孵育，以β-actin为内参。加入二抗孵育1 h，ECL显色，暗室曝光显影，每组设7个复孔，凝胶成像系统获得蛋白条带图片，采用Image J软件分析目标蛋白表达情况。

PKH-26为膜标记染料，可与外泌体脂膜结合并发出红色荧光，可用于外泌体存在的鉴定。将1 μLPKH-26染料与100 μL外泌体孵育，加入1 mLDiluent C，加入200 μL1% BSA/PBS，再加入3 μLPKH-26染料孵育20 min，100 000 g离心70 min，获得标记好的外泌体沉淀。将HeLa细胞置于12孔板中培养，达70%融合时更换为含标记好的外泌体的新鲜培养基孵育24 h，PBS清洗，多聚甲醛固定20 min，DAPI染色细胞核，共聚焦荧光显微镜下观察HeLa细胞摄取外泌体情况。

用Matrigal胶包被Transwell小室上室。用无血清培养基饥饿培养HeLa细胞12 h，用胰蛋白酶消化细胞，1000 g离心5 min，PBS清洗，用含BSA的无血清培养基重悬HeLa细胞，调整HeLa细胞密度为1 × 10⁵ mL^-1，取200 μL细胞悬液加入Transwell小室的上室，并设外泌体组(Exo组)和对照组，Exo组细胞中加入20 μL外泌体悬液，对照组细胞中加入20 μL无血清培养基，每组设7个复孔。小室的下室加入去除外泌体的培养基，培养24 h后，棉签擦去基质胶及上室细胞，PBS冲洗，结晶紫染色，显微镜下观察并计算侵袭细胞数，代表细胞迁移能力。

在12孔板背后用记号笔均匀划3条平行横线，横线横穿过孔，间隔0.8 cm。调整对数生长的HeLa细胞密度为1 × 10⁵ mL^-1，在12孔板中加入HeLa细胞过夜孵育，24 h后用10 μL枪头垂直背后横线垂直划痕，PBS冲洗去除划下细胞，细胞分为Exo组和对照组，Exo组细胞总加入含外泌体悬液50 μL的无血清培养基，对照组细胞加入等量无血清培养基，置于培养箱中培养，分别于0 h和24 h拍照观察细胞迁移距离，代表细胞迁移能力。每组设7个复孔。

将HeLa细胞分为Exo组和对照组，接种到培养皿中培养至细胞达80%以上融合时，更换培养基，Exo组细胞中加入含50 μL外泌体悬液的培养基，对照组加入50 μL不含外泌体的培养基培养，每组设7个复孔。24 h后提取各组细胞总蛋白，以兔抗人Wnt1、兔抗人β-catenin和兔抗人TCF4抗体为一抗，稀释比例为1:1000，采用Western blotting法检测细胞中Wnt1、β-catenin和TCF4蛋白表达水平，具体步骤见“1.6”。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值。

采用SPSS20.0统计软件进行统计学分析。各组HeLa细胞中侵袭细胞数和迁移距离、细胞中Wnt1、β-catenin和TCF4蛋白表达水平符合正态分布，以x±s表示，2组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

透射电镜下观察：通过超速离心法获得HeLa细胞培养上清中有呈圆形或椭圆形、直径为40 ~ 100 nm的囊泡状小体。Western blotting法检测结果显示：囊泡状小体中富含CD63蛋白和CD81蛋白，表明HeLa细胞中分离的物质为外泌体。见图 1和图 2。

A: Bar = 100 nm; B: Bar = 25 nm. 图 1 电镜下观察HeLa细胞来源外泌体形态表现 Fig. 1 Morphology of HeLa cells-derived exosomes observed under electron microscope

图选项

Lane 1:Control group; Lane 2:Exo group. 图 2 Western blotting法检测各组HeLa细胞来源外泌体中CD63和CD81蛋白表达电泳图 Fig. 2 Electrophoregram of expressions of CD63 and CD81 proteins in HeLa cells-derived exosomes detected by Western blotting method

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HeLa细胞外泌体采用PKH26荧光标记(PKH26染剂不影响外泌体特性，且可与外泌体膜结构稳定结合发出红色荧光)，HeLa细胞用DAPI荧光进行核染色，培养24 h，共聚焦荧光显微镜观察，对照组HeLa细胞膜表面无标记外泌体附着，Exo组HeLa细胞膜表面有标记的外泌体附着。见图 3(插页七)。

A—C:Control group; D—F: Exo group; A, D: PKH26; B, E:DAPI; C, F:Merg. 图 3 HeLa细胞外泌体的PKH26和DAPI荧光标记（×100） Fig. 3 PKH26 and DAPI fluorescence labeling of exosomes in HeLa cells (×100)

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Transwell小室实验结果显示：与对照组比较，Exo组HeLa细胞中侵袭细胞数明显升高(P＜0.01)。见图 4和表 1。

A:Cotrol group; B:Exo group. 图 4 Transwell小室实验检测2组HeLa细胞侵袭能力(×200) Fig. 4 Invasion abilities of HeLa cells in two groups detected by Transwell chamber experiment (×200)

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与对照组比较，Exo组HeLa细胞迁移距离明显增加(P＜0.01)。见表 1和图 5。

A, B:0 h; C, D:24 h; A, C:Control group; B, D:Exo group. 图 5 细胞划痕实验检测2组HeLa细胞迁移距离 Fig. 5 Migration distance of HeLa cells in two groups detected by cell scratch assay

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与对照组比较，Exo组HeLa细胞中Wnt1、β-catenin和TCF4蛋白表达水平均明显升高(P＜0.01)。见表 2和图 6。

Lane 1:Control group; Lane 2:Exo group. 图 6 Western blotting法检测2组HeLa细胞中Wnt1、β-catenin和TCF4蛋白表达电泳图 Fig. 6 Electrophoregram of expressions of Wnt1, β-catenin and TCF4 proteins in HeLa cells detected by Western blotting method

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外泌体是一种细胞外囊泡，直径为50~140 nm，由细胞经过内吞、融合-外排等调控过程形成；外泌体通过携带蛋白质、核酸等生物活性小分子在细胞之间进行信号传递^[5]。外泌体可从各种体液、细胞培养液上清中分离，其功能和组成由其细胞来源决定^[6]。外泌体在恶性肿瘤微环境中含量非常丰富，在恶性肿瘤的侵袭和转移中发挥重要作用^[7]。如肿瘤来源的外泌体增强涎腺腺样囊性癌细胞的侵袭和转移^[8]，M2巨噬细胞来源的外泌体促进结肠癌细胞迁移和侵袭^[9]，食管癌细胞来源外泌体促进食管癌细胞的迁移和侵袭能力^[10]，胰腺癌外泌体促进肿瘤转移^[11]。本研究采用超速离心法成功分离得到宫颈癌HeLa细胞外泌体，并发现HeLa细胞来源外泌体可促进HeLa细胞本身侵袭和迁移能力，表明宫颈癌HeLa细胞外泌体在其自身侵袭和迁移过程中也发挥重要作用，但其作用机制尚不清楚。

为探讨宫颈癌HeLa细胞外泌体在宫颈癌HeLa细胞侵袭和迁移中的作用机制，本文作者对HeLa细胞中Wnt/β-catenin信号通路及其下游基因进行研究，结果显示：宫颈癌HeLa细胞来源外泌体可升高HeLa细胞中Wnt1、β-catenin和TCF4蛋白表达水平。Wnt/β-catenin信号通路在恶性肿瘤细胞的侵袭和迁移中发挥重要作用，宫颈癌的侵袭迁移与Wnt/β-catenin信号通路关系密切^[11-12]。β-catenin在细胞中以游离型和结合型两种形式存在，结合型β-catenin通过与上皮钙黏蛋白结合调节恶性肿瘤细胞之间的黏附；游离型β-catenin通过Wnt信号通路作用于恶性肿瘤细胞核内的转录因子淋巴增强因子/T细胞因子(LEF/TCF)在恶性肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用^[13-14]。Wnt/β-catenin信号通路的激活机制比较复杂，在Wnt蛋白缺失的情况下，细胞中的β-catenin被磷酸化，磷酸化的β-catenin由蛋白酶降解，因此在细胞内保持比较低的水平；在Wnt蛋白存在的条件下，β-catenin磷酸化水平低，导致胞内β-catenin大量积累，随后进入细胞核中，可在细胞核中与LEF/TCF形成复合物，调控相关基因表达，参与恶性肿瘤细胞的侵袭和迁移过程^[15-16]。TCF家族为Wnt信号通路的分子开关，在恶性肿瘤的侵袭和转移中发挥重要作用，尤其是TCF4与恶性肿瘤的发生发展有密切关联^[17-18]。在宫颈癌中Wnt/β-catenin信号通路激活，Wnt1和β-catenin蛋白表达水平升高，其下游的TCF4蛋白表达水平也升高。外泌体可通过Wnt/β-catenin信号通路发挥生物学作用，如脂肪来源间充质干细胞外泌体通过Wnt /β-catenin信号通路保护心肌免受缺血/再灌注损伤^[19]；缺氧结直肠癌细胞来源外来体通过Wnt/β-catenin信号传导促进血管生成^[20]；骨髓间充质干细胞来源外泌体通过Wnt/β-catenin途径促进胃癌进展^[21]。本研究中宫颈癌HeLa细胞来源外泌体可升高HeLa细胞中Wnt1、β-catenin和TCF4蛋白表达水平，表明宫颈癌HeLa细胞来源外泌体可能通过促进Wnt/β-catenin信号通路及其下游的TCF4基因抑制宫颈癌细胞的侵袭和迁移过程。

综上所述，宫颈癌HeLa细胞来源的外泌体可促进宫颈癌细胞的侵袭和迁移能力，其机制可能与HeLa细胞来源外泌体可促进Wnt /β-catenin信号通路的激活及下游TCF4基因的表达有关。