前列腺素E1(prostaglandin E1，PGE1)也称前列地尔，是临床上治疗勃起功能障碍的局部用药物^[1]，对糖尿病^[2]和肾损伤^[3]等疾病也有疗效。目前市场上合成PGE1主要通过化学合成法和生物合成法^[4]，但是产出率低，且增加了环境污染的风险。利用羊精囊中存在的天然环氧合酶(cyclooxygenase，COX)，催化二十碳不饱和脂肪酸发生环氧化反应可生成PGE1^[5]。但是羊精囊资源有限，成本极高，且存在人畜共患病的潜在风险。如果能够通过基因工程手段实现COX的体外表达，既能提高PGE1产量，又能控制生产过程，降低风险。

COX有2种亚型：COX1和COX2^[6]，二者是同工酶，COX1是结构酶，而COX2是诱导酶，主要作用是促进PGE的合成。目前，对于COX1研究多倾向于药理学和药效学研究领域，如COX1对化学肝损伤的保护作用、调节动脉粥样硬化、参与直肠癌和胃癌的发生发展等，而对其真核表达载体的构建和体外表达COX1的酶活性报道较少。COX1为一种膜整合蛋白，由599或600个氨基酸残基组成，含有23或24个氨基酸残基构成的信号肽^[7]。本研究通过构建人COX1基因真核表达载体，并在HEK-293F细胞中表达，验证COX1酶催化活性，以期寻找替代羊精囊合成PGE1的新途径。

新鲜羊精囊，购于吉林省吉林市江南批发市场。pCMV6-Entry Vector和感受态细胞E.coli DH5-α购自北京天根生化科技有限公司，人胚肾细胞HEK-293F由实验室保存，人微血管内皮细胞(human microvascular endothelial cells, HMECs)购自上海研谨生物科技有限公司。质粒提取试剂盒和RNA提取试剂盒购自北京全式金生物科技有限公司，逆转录试剂盒购自江苏省吴江近岸蛋白质科技有限公司，EndoFectin^TM-Expi293转染试剂购自北京义翘神州生物科技有限公司，T4 DNA连接酶、Sgf Ⅰ和Mlu Ⅰ限制性内切酶购自北京NEB生物科技有限公司，PGE1检测试剂盒购于上海泽叶生物科技有限公司，Anti-Myc-Tag mAb (HRP- Conjugated)、HRP-Goat Anti-Mouse IgG(H+L)和ECL化学发光试剂盒购自美国Abmart公司。K160 PCR扩增仪(力康生物科技有限公司)，GelDoc EZ凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)，CO₂培养箱(美国赛默飞公司)。

根据GenBank中COX1编码基因序列(coding sequence，CDS)NM_000962，由生工生物工程(上海)股份有限公司设计特异性引物并合成。引物序列(上游引物下划线为Sgf Ⅰ酶切位点，下游引物下划线为Mlu Ⅰ酶切位点)：上游引物5′- ATGCGATCGC-ATGAGCCGGAGTCTCTTGCTCC-3′，下游引物5′-CGACGCGTTCAGAGCTCTGTGGATGGTCG-CTC-3′。

采用RNA提取试剂盒提取HMECs总RNA后，逆转录成cDNA，以cDNA为模板，采用常规PCR扩增COX1基因。逆转录体系及步骤参照逆转录试剂盒说明书。PCR反应体系：模板1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，2×Taq Mix 12 μL，灭菌水10 μL。PCR反应条件：95℃、5 min；95℃、45 s, 60℃、45 s, 72℃、1 min，30个循环；72℃、10 min。

将PCR产物利用胶回收试剂盒纯化回收，采用Sgf Ⅰ酶和Mlu Ⅰ酶分别对pCMV6载体和COX1 PCR扩增产物37℃双酶切1 h，DNA电泳，胶回收目的条带(载体约4 900 bp，COX1目的基因约1 800 bp)，T4 DNA连接酶16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5-α感受态细胞，涂布于Kana⁺的LB平板，37℃倒置培养12~16 h。

挑取单菌落，接种于LB液体培养基，37℃、180 r·min^-1振荡培养24 h，提取质粒，分别采用双酶切法和PCR法鉴定。阳性克隆测序，与COX1基因序列进行比对。

采用Expasy数据库中的ProtParam工具分析蛋白质的疏水性^[8]；采用SignalP 4.1软件分析蛋白信号肽，采用TMHMM Server v.2.0在线分析软件预测COX1蛋白跨膜区域^[9]，采用NetPhos 3.1 Server在线工具分析磷酸化位点，采用PSIPRED方法预测蛋白质的二级结构^[10]；采用SWISS-MODEL程序进行折叠模式识别，并用Qmean工具进行评估，选取最佳三级结构结果^[11]。

接种阳性克隆于150 mL LB液体培养基中，37℃、180 r·min^-1振荡培养24 h，提取质粒，取30 μg无内毒素质粒，根据EndoFectin^TM-Expi293转染试剂操作说明书，转染入7.5×10⁷ mL^-1的HEK-293F细胞中(25 mL)，5% CO₂培养箱中培养，分为转染重组质粒2 d组和转染重组质粒5 d组，同时设未转染的HEK-293F细胞为对照组，分别收集各组细胞培养上清及细胞，细胞超声破碎提取总蛋白，细胞培养上清经超滤浓缩，Western blotting法检测COX1蛋白表达水平，以Image J V1.8.0软件分析条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值与GAPDH条带灰度值比值代表COX1蛋白表达水平。

将5个羊精囊去除脂肪和结缔组织后称质量，剪碎后加入2倍质量的0.154 mol·L^-1 KCl匀浆，9 000 r·min^-1离心10 min，取上清，重复2次，合并上清液，用2 mol·L^-1柠檬酸调节pH值至4.8~5.0，9 000 r·min^-1离心10 min，取沉淀，加入25 mL磷酸盐/EDTA-Na₂缓冲液(pH值8.2磷酸盐缓冲液:0.125 mol·L^-1 EDTA-Na₂=9:1)重悬，备用^[5]。

酶促反应体系^[5]：转染后HEK-293F细胞上清或羊精囊提取的COX1粗酶(40%)、对苯二酚(0.01%)、还原型谷胱甘肽(0.1%)和二高- γ-亚麻酸(1%和5%)，以磷酸盐/EDTA-Na₂缓冲液补足体积至5 mL，加入二高-γ-亚麻酸后立即搅拌，通入足量空气，37℃水浴或者温箱中反应1 h，2000 r·min^-1离心10 min，取上清，采用PGE1试剂盒检测，以梯度稀释的标准品浓度为横坐标，吸光度(A)值为纵坐标，绘制标准曲线，每个样品重复测定3次。

采用Origin 8.0统计软件进行统计学分析。各组细胞中和培养上清中COX1蛋白表达水平及PGE1含量均符合正态分布，以x±s表示，2组间样本均数比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

以HMECs的cDNA为模板，利用PCR法扩增目的基因COX1，扩增产物与实际大小一致，约1800 bp。见图 1。

Lane 1:DNA marker; Lane 2:COX1 gene. 图 1 COX1基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图 Fig. 1 Agarose gel electrophoregram of PCR amplification product of COX1 gene

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提取的重组质粒经Sgf Ⅰ和Mlu Ⅰ双酶切，酶切5 min和10 min效果比较无明显差异，得到目的基因COX1和载体pCMV6-Entry2个片段。见图 2。

Lane 1: DL5 000 DNA marker; Lane 2: Recombinant plasmid; Lane 3: Product digested by double enzyme for 5 min; Lane 4: Product digested by double enzyme for 10 min; Lane 5, 6: DL2 000 DNA marker; Lane 7: COX1 gene. 图 2 重组质粒pCMV6-COX1双酶切鉴定(A)和PCR法鉴定(B)琼脂糖凝胶电泳图 Fig. 2 Agarose gel electrophoregram of pCMV6-COX1 identified by double enzyme digestion (A) and PCR (B)

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经双酶切鉴定成功的质粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果与美国国家生物技术信息公司(NCBI)网站上的COX1全基因序列进行比对，结果显示无明显差异，测序比对结果见图 3(插页四)。

图 3 COX1重组质粒与GenBank数据库序列BLAST比对分析 Fig. 3 BLAST analysis of COX1 sequence between recombinant plasmid and GenBank database

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COX1编码区蛋白有658个氨基酸，总平均亲水性(grand average of hydropathicity, GRAVY)值为-0.217，相对分子质量为75 321.09，等电点为8.28，不稳定指数为46.36，说明该蛋白为水溶性蛋白，但稳定型差。采用SignalP 4.1软件在线分析COX1蛋白，显示其含有信号肽，位置在1~53位氨基酸(图 4, 见插页四)。采用TMHMM Server v.2.0在线分析软件预测COX1蛋白跨膜区域，采用NetPhos 3.1 Server在线工具分析磷酸化位点，结果显示：34~53位氨基酸处于跨膜区域(图 5A, 见插页四)，COX1蛋白有36个丝氨酸磷酸化位点，14个苏氨酸磷酸化位点，9个酪氨酸磷酸化位点(图 5B, 见插页四)。

图 4 SignalP 4.1在线软件预测COX1蛋白信号肽序列 Fig. 4 Signal peptide sequence of COX1 protein predicted by SignalP 4.1 online tool

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图 5 TMHMM Server v.2.0在线分析软件预测COX1蛋白跨膜区域(A)和NetPhos 3.1 Server在线工具预测COX1蛋白磷酸化位点(B) Fig. 5 Transmembrane regions of COX1 protein predicted by TMHMM Server v.2.0 online analysis software (A) and phosphorylation sites of COX1 protein predicted by NetPhos 3.1 Server online tool (B)

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采用PSIPRED方法预测COX1蛋白的二级结构，采用SWISS-MODEL程序预测三级结构。COX1二级结构中，不规则卷曲所占比例最大(46.2%)，其次为α螺旋(41.03%)，延伸链和β-转角分别占10.18%和2.58%。COX1蛋白三级结构较为致密，分子结构中存在较多的α螺旋和不规则卷曲，与二级结构预测结果一致。见图 6(插页四)和图 7(插页四)。

图 6 PSIPRED在线工具预测COX1蛋白二级结构 Fig. 6 Secondary structure of COX1 protein predicted by PSIPRED online tool

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图 7 SWISS-MODEL在线工具预测COX1蛋白三级结构 Fig. 7 Tertiary structure of COX1 protein predicted by SWISS-MODEL online tool

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分别收集转染重组质粒2 d和5 d组HEK-293F细胞和细胞培养上清，利用Western blotting法检测COX1蛋白表达水平，结果显示：COX1蛋白相对分子质量约为70 000，与实际大小一致。转染COX1基因的HEK-293F细胞和细胞培养上清中均表达COX1蛋白，转染重组质粒2 d组与转染重组质粒5 d组细胞中COX1蛋白表达水平(0.71±0.03和0.67±0.08)比较差异无统计学意义(P＞0.05)，但转染重组质粒5 d组细胞培养上清中COX1蛋白表达水平(5.93±0.25)明显高于转染重组质粒2 d组(4.93±0.37)(P＜0.05)。见图 8。

M: Protein marker; Lane 1:Cells in control group; Lane 2: Cell culture supernatants in control group; Lane 3: Cells in transfection 2 d group; Lane 4: Cells in transfection 5 d group; Lane 5: Cell culture supernatants in transfection 2 d group; Lane 6: Cell culture supernatants in transfection 5 d group. 图 8 Western blotting法检测各组HEK-293F细胞和细胞培养上清中COX1蛋白表达电泳图 Fig. 8 Electropherogram of COX1 protein expressions in HEK-293F cells and cell culture supernatants in various groups detected by Western blotting method

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以二高-γ-亚麻酸(1%和5%)为底物，按照PGE1检测试剂盒使用说明书，绘制得标准曲线Y= 671.32X－33.113(R²= 0.9993)，分别计算细胞培养上清中真核表达COX1蛋白和羊精囊提取粗酶混合物催化底物合成PGE1含量，真核表达COX1蛋白能够催化底物合成PGE1，其活性相当于为5个羊精囊提取的粗酶活性的(90.30±0.06)%。见表 1。

PGE1具有广泛的药理和生理作用，包括扩张血管、保护缺血心肌、改善心功能和治疗糖尿病等^[12-13]，临床上用来治疗各种心脏病、慢性呼吸疾病和各种类型肝炎等多种疾病^[14-16]，市场需求量大。目前虽然实现了PGE1的生物合成和化学合成，但是化学合成方法步骤复杂，副产物多，纯化困难，生产量一直受限；而生物合成由于使用的羊精囊属于动物组织来源，受到原料局限，且容易增加人畜共患病风险，导致PGE1产品价格居高不下。

研究^[17-18]表明：COX1是生物合成PGE1的关键酶，COX1通过催化花生四烯酸氧化合成PGE1，一般情况COX1主要存在于胃、肠道上皮细胞和血管内皮细胞中，起到保护黏膜细胞和改变血管张力的作用。在胃肠疾病中，尤其是胃肠道炎症和肿瘤组织中，常见COX1异常表达^[19-20]，但其在各种胃肠疾病中的作用机制至今尚不清楚。研究^[21]显示：COX1在正常黏膜组织中长期存在，是稳态的维持者和PGE1的分泌者。生理条件下，COX1的表达量维持在一个稳定的状态，很难满足PGE1大量生产的要求。

获取COX1的编码区并构建其真核表达载体是研究COX1生理功能及其在PGE1体外生物合成过程中作用的基础。本研究首先成功构建pCMV6-COX1重组载体，双酶切、PCR和测序结果表明：目的基因COX1成功连接到真核表达载体pCMV6。随后通过生物信息学分析了COX1蛋白编码区的结果显示：COX蛋白含有信号肽，包含跨膜区，属于分泌型蛋白，在真核表达系统HEK-293F细胞中表达后，COX1蛋白主要分泌在细胞培养基中，也验证了生物信息学预测结果的可靠性，真核表达的COX1蛋白有利于后续纯化，且蛋白结构更接近天然活性蛋白状态，结构完整，可用于研究COX1的更多生理功能和新型抑制剂的开发。

为了验证真核表达的COX1有环氧合酶催化活性，能够催化二高-γ-亚麻酸合成PGE1，本研究建立了一个体外酶促反应体系，同时与羊精囊粗酶提取物活性进行比较，结果表明：25 mL细胞培养上清预处理后，其酶活性与5个羊精囊制备的粗酶活性相当，解决了羊精囊提取的粗酶混合物催化合成PGE1生产方法效率低、质量不稳定的瓶颈，为高效合成PGE1提供了新的方法。故通过优化表达工艺和纯化COX1蛋白等手段可以进一步提高COX1蛋白的酶活性，进而提高PGE1产量。

综上所述，本研究获得的COX1蛋白具有理想的体外催化特性，构建的pCMV6-COX1重组载体为后续深入研究COX1的生理功能和其在病理过程中的作用以及筛选COX1抑制剂的研究奠定了基础。