绝经后骨质疏松(postmenopausal osteoporosis，PMO)是一种雌激素缺乏引起的失衡性骨代谢疾病，因净骨吸收大于骨生成导致躯干骨的骨折，严重影响了中老年女性的生活质量^[1]。口腔颌面骨流失近年来也被临床和动物实验研究^[2-3]所证实，且PMO并发牙周炎患者牙槽骨吸收更为严重^[3]。传统观念认为雌激素缺乏导致钙吸收和代谢障碍是PMO的主要发病机制，然而炎症性疾病、自身免疫疾病与骨质疏松在涉及骨病损时表现出类似的疾病特征，提示免疫防御参与了骨疾病发展且起到枢纽作用^[4-5]。T细胞为特异性免疫应答中的一类淋巴细胞，可通过调控造血干细胞归巢及成骨细胞分化、分泌白细胞介素类的炎症因子，结合受体表达骨调控相关基因WNT10B和核因子κB受体活化因子配基(receptor activator of nuclear factor-κBligand, RANKL)等多种方式参与调控成骨与破骨平衡^[6]。

辅助性T细胞17(T helper cell 17, Th17)亚群是最近发现的CD4⁺T细胞亚群，在细胞介导的组织反应中起重要作用，研究^[7]证实：Th17在多种自身免疫性疾病(类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和哮喘等)中起重要作用。牙周病是一种牙周支持组织的感染性疾病。2009年研究人员首次在牙周炎患者牙龈中检测到Th17细胞^[8]。炎性状态下Th17细胞和负调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)的动态平衡向Th17细胞方向移动，参与牙周病损的发生^[9]。白细胞介素17(interleukin-17, IL-17)是Th17细胞分泌的抗外源性微生物的重要炎性因子，在牙周炎患者牙周组织中高表达^[8]，然而IL-17在健康牙周组织中的表达及其与雌激素缺乏的关系尚不明确。

益生菌的摄入有助于改善免疫系统推动了益生菌奶制品及饮品的普及，尽管这一观念缺乏可靠的临床数据，但最近粪便微生物移植的研究再次将益生菌带入科学前沿^[10]。小范围的临床研究证实益生菌对骨质疏松也具有治疗作用^[11]，动物实验提示益生菌可抑制肠炎导致的IL-17表达水平升高^[12]。外周血IL-17和RANKL水平与骨矿化密度有密切关联^[13]，益生菌是否对牙周IL-17具有调节作用是本研究要解决的问题。本研究采用卵巢摘除致雌激素缺乏小鼠模型，探讨雌激素缺乏及益生菌干预对小鼠牙龈及骨髓组织中炎性因子IL-17表达的影响，阐明雌激素缺乏与牙周炎关联性的可能机制。

8周龄SPF级健康C57BL/6J雌性小鼠，体质量16.5~17.5 g，购买于广东省医学动物实验中心，动物使用许可证号：SCXK(粤)2013-0003。PBS、DMEM培养基、α-MEM培养基、胎牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA)、青/链双抗和胰蛋白酶(美国Gibco公司)，中性甲醛(中国博士德公司)，含鼠李乳糖杆菌(Lactobacillus rhamnosus GG，LGG)的Culturelle Pro-well益生菌(美国iHealth公司)，红细胞裂解液和PMA/Ionomycin(美国Thermofisher公司)，TRIzol(美国Invitrogen公司)，Prime Script逆转录试剂盒和SYSB Prime Ex Taq^TMⅡ试剂盒(日本TaKaRa公司)，FITC标记抗小鼠T细胞抗原受体β(T cell receptor β, TCRβ)、PerCP标记抗小鼠CD4和PE标记抗小鼠IL-17(美国Biolegend公司)。双能X线骨密度仪(美国GE公司)，流式细胞仪(美国BD Biosciences公司)，ABI 7300型实时定量qPCR仪(美国Applied Biosystems公司)。

15只小鼠饲养于23℃~25℃和40%~60%相对湿度环境中，自由饮食适应性饲养1周后，随机分为假手术组、卵巢摘除组和益生菌干预组，每组5只。假手术组小鼠行双侧背部手术切口后直接缝合；卵巢摘除组小鼠行双侧卵巢摘除手术；益生菌干预组小鼠行双侧卵巢摘除手术，术后第2天起，每日灌服益生菌1次(0.5 mL)；2周后处死小鼠。LGG的灌服量依照人与动物的剂量换算，计算小鼠的等效剂量。婴儿服用LGG量为每天1 500 mg，小鼠的等效剂量=1 500 mg·15 kg^-1= 100 mg·kg^-1，按照小鼠体质量计算，每只小鼠每天需要2 mg。将含LGG的益生菌1000 mg稀释至20 mLPBS载体溶液中，充分溶解后，使用1 mL注射器每只每天灌服0.5 mL，实验重复3次。本实验通过广州医科大学附属口腔医院伦理委员会伦理审查，严格按照动物使用和关怀指导的原则进行相关实验步骤。

麻醉后处死小鼠，获取小鼠左侧股骨，股骨标本沿长轴固定于扫描台上进行扫描，采用图像分析软件计算获得总体BMD，对比模型建立时及处死时BMD的变化。ΔBMD=BMD_2周－BMD_初始，BMD变化百分率＝ΔBMD/BMD_初始×100%。

小鼠骨髓细胞离心后提取总RNA，检测IL-17 mRNA基因的表达。另取小鼠下牙颌第一磨牙牙龈组织，按照TRIzol试剂盒说明书提取总RNA。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。IL-17引物序列：上游引物5′-TTGGAGGCAGACACCCACC-3′，下游引物5′-GATAGCGGTCCTCATCCGTG-3。取1 μg RNA样本, 按照Prime Script逆转录试剂盒说明书操作得到模板cDNA, 以cDNA为模板扩增。反应条件：95℃、10 min; 95℃、15 s，58℃、30 s，72℃、30 s，循环35次。采用2^-ΔΔCt法计算IL-17 mRNA表达水平。

取小鼠右侧股骨，剔除附着肌肉组织暴露股骨和胫骨，将分离的骨组织置于盛有DEME的培养皿中，无菌眼科剪断长骨，暴露骨髓腔，用1 mL无菌注射器抽取含10%血清的DEME培养液反复从骨髓腔一端冲洗至另一端，直至骨髓腔发白，吸管反复吹打冲出之骨髓组织培养液，加入红细胞裂解液裂解后反复漂洗，获得骨髓细胞，取3/4细胞进行流式细胞术检测。将细胞离心放入96孔板，用含10%胎牛血清的培养基重悬单个核细胞，使细胞浓度为1×10⁷ mL^-1，使用含有PMA/Ionomycin的活化培养基刺激4 h，每隔1~2 h取出震荡混匀。所得到的上述细胞用含1% BAS的预冷PBS洗涤2次，300 g离心5 min，分别加入含有100 μL CD4、TCRβ和IL-17的抗体，室温避光放置30 min进行染色，每管加入2 mL预冷1倍流式细胞染色液漂洗，300 g离心5 min后弃上清，洗涤并重悬细胞，通过流式细胞仪测定Th17细胞数量，计算小鼠骨髓中Th17细胞占CD4⁺TCRβ⁺细胞的百分率。

采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析。小鼠股骨BMD及其变化百分率、骨髓细胞及牙龈组织中IL-17 mRNA表达水平和骨髓Th17细胞占CD4⁺TCRβ⁺细胞百分率先予以正态分布检验，均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

与假手术组比较，术后2周卵巢摘除组小鼠BMD及其变化百分率明显降低(P＜0.05)，益生菌干预组小鼠BMD及其变化百分率差异无统计学意义(P＞0.05)。与卵巢摘除组比较，益生菌干预组小鼠BMD及其变化百分率明显升高(P＜0.05)。见表 1。

与假手术组比较，卵巢摘除组小鼠骨髓细胞和牙龈组织中IL-17 mRNA表达水平明显升高(P＜0.05)。与卵巢摘除组比较，益生菌干预组小鼠骨髓细胞和牙龈组织中IL-17 mRNA表达水平明显降低(P＜0.05)，且与假手术组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表 2。

与假手术组比较，卵巢摘除组小鼠骨髓中Th17细胞占CD4⁺TCRβ⁺细胞百分率明显升高(P＜0.05)；与卵巢摘除组比较，益生菌干预组小鼠骨髓中Th17细胞占CD4⁺TCRβ⁺细胞百分率明显降低(P＜0.01)，但与假手术组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见图 1。

1:Sham operation group; 2:Ovariectomy group; 3:Probiotics group.*P < 0.05 vs sham operation group; △P < 0.05 vs ovariectomy group. 图 1 各组小鼠骨髓中Th17细胞占CD4+TCRβ+细胞百分率 Fig. 1 Percentages of Th17 cells in CD4+TCRβ+ cells in bone marrow of mice in various groups

图选项

IL-17是一种强大的炎性因子及炎症反应调节因子，其受体存在于多种细胞(成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞)中，除了通过诱导细胞RANKL的表达直接介导破骨细胞生成外，IL-17还能刺激单核细胞和成纤维细胞等分泌前列腺素E及粒细胞集落刺激因子促进淋巴细胞增殖分化放大炎症，在自身免疫中起重要作用^[14]。在牙周炎症中IL-17可通过刺激核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)在内皮细胞、成纤维细胞中的转录，诱导T细胞增殖起到放大炎症的作用^[15]。然而IL-17在牙周疾病中主要起保护作用还是破坏作用尚有争议，尽管多项研究^{[8, 16-18]}显示：IL-17促进破骨细胞增殖和分化，且IL-17水平与骨吸收有密切关联，然而IL-17受体敲除小鼠的牙周易感性增加，牙周病病损更严重，且雌性小鼠更易感，提示IL-17在牙周炎中的保护作用和促进作用的矛盾关系。研究^[19]显示：IL-17在牙周粒细胞招募中不可或缺，对抵抗病源菌对牙槽骨的损害起着关键作用。本研究结果显示：卵巢摘除致雌激素缺乏小鼠牙龈组织中IL-17表达水平上调，骨髓中Th17细胞在CD4⁺TCRβ⁺细胞中的百分率升高，与骨质疏松存在关联性。

菌群与人体健康之间的关系日益得到重视，菌群在正常生理活动及疾病中均扮演重要角色。除了影响人体肠内分泌细胞、肠道通透性及免疫系统的功能，调节宿主能量的吸收及代谢，肠道菌群还是人体免疫功能的重要部分^[20-21]。肠道T细胞占所有淋巴器官中T细胞比例高达50%，肠道是除了胸腺外T细胞激活的主要场所。研究^[22-24]显示：无细菌环境下的小鼠骨密度高于正常小鼠，将其放入有菌环境其骨密度会回到正常范围，猜测与肠道中的特定菌群特异性诱导Th17细胞分化有关，而骨质疏松引起的肠道通透性增加可使小鼠肠道菌群发生变化。菌群异常可导致骨密度异常，为研究益生菌是否具有增加骨密度的作用，有研究者通过对低钙饲料饲养的大鼠喂食高产维生素K7的益生菌，发现其可预防钙摄入不足引起的骨质疏松^[25]。本研究结果显示：灌服含LGG益生菌，可阻止小鼠因雌激素缺乏导致的骨质疏松，并降低小鼠牙龈组织中IL-17的表达，提示益生菌在牙周疾患中具有预防作用；同时由于益生菌这一作用，通过降低骨髓CD4⁺TCRβ⁺细胞中Th17细胞的比例，降低骨髓中炎症因子IL-17mRNA表达，表明牙龈组织中的IL-17可能为部分骨髓Th17细胞通过外周循环游走到牙龈。随机双盲临床对照试验^[26]提示：益生菌可能改善牙周炎所致附着丧失，与本研究结果益生菌降低雌激素分泌不足小鼠牙龈组织中IL-17的表达这一现象，共同提示其对牙周炎的治疗作用可能是通过降低牙周组织中IL-17表达而实现的。

自身免疫疾病中女性发病率明显高于男性这一现象，引发了大量雌激素相关的实验研究。雌激素受体α(estrogen receptor α，ERα)存在于人体大多数细胞(成骨细胞、破骨细胞及免疫细胞)中，雌激素通过与ERα结合，直接激活基因启动子中的雌激素反应元件，或作为辅因子与其他转录因子激活反应原件如NF-κB/AP1的间接激活作用，发挥生物学效应。传统理论^[27]认为：雌激素通过与成骨和破骨细胞相应受体结合，促进成骨细胞分化和破骨细胞凋亡，抑制RANKL表达，调控骨平衡。T细胞表面受体敲除实验结果^[28]显示：T细胞与自身免疫性疾病关系密切。T细胞表面ERα与雌激素结合后，通过白细胞介素的表达、细胞因子受体的表达和效应T细胞的激活发挥调控作用^[29]。T细胞除了通过分泌RANKL参与骨关节炎的疾病发展外，还可通过Th1细胞分泌的γ-干扰素(interferon γ，IFN-γ)及Th17细胞分泌的IL-17参与牙周炎的进展^[30]。卵巢摘除的T细胞缺陷裸鼠不会发生骨质疏松^[31]，Th17细胞敲除的小鼠能免受炎症引起的牙周骨吸收^[32]，提示Th17细胞可能在牙周炎症及骨质疏松中起重要作用。由于在本研究中，雌激素缺乏导致小鼠股骨骨髓细胞中Th17细胞的比例上升，推断益生菌干预通过降低了Th17细胞的比例及IL-17的表达水平预防了骨质疏松的发生，IL-17水平升高可能参与了躯干骨骨密度的降低及牙周骨密度的降低(本研究中由于颌骨无炎症刺激，仅观察了IL-17基因的表达)。在牙周致病菌的局部因素作用下，IL-17放大免疫反应并介导破骨反应，是绝经后骨质疏松妇女发生牙周炎的可能机制，益生菌干预配合牙周治疗对雌激素缺乏导致的牙周炎有预防作用。

综上所述，通过益生菌干预处理卵巢摘除致雌激素缺乏小鼠，可阻止因雌激素缺乏导致的小鼠牙龈组织和骨髓细胞中IL-17基因上调及骨髓细胞Th17细胞的比例，起到预防因雌激素缺乏所致牙周炎的作用。本研究为雌激素缺乏导致的骨质疏松与牙周炎关联性研究提供了理论依据，但其具体机制尚需进一步研究。