慢性心力衰竭(chronic heart failure, CHF)是各种心血管疾病的终末阶段，是一种复杂性、系统性的临床综合征，具有容易复发和预后差的特点^[1]。目前，临床上对CHF的治疗主要采用血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂、血管紧张素转化酶抑制剂、醛固酮拮抗剂和β-受体阻滞剂等，但不能从根本上解决其发病率高和死亡率高的状况^[2-3]。近年来，中药在防治CHF方面展现出安全、高效和不良反应少的优势。三七总皂苷是中药三七的主要成分之一，具有改善心肌缺血再灌注损伤、增加血液循环和改善血流供应的作用^[4-5]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)信号通路主要包括细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal protein kinase, JNK)和p38激酶3个亚族，对心肌保护发挥重要作用^[6]。目前国内关于三七总皂苷应用于CHF治疗效果的研究^[7-8]表明：三七总皂苷能有效改善CHF患者心功能，降低细胞凋亡相关因子水平，但对其作用机制研究甚少。本研究旨在观察三七总皂苷对CHF模型大鼠心脏功能的影响，探讨其作用机制，为临床治疗CHF提供新思路。

SPD级SD大鼠75只，体质量(220±20) g，购自河北省以岭医药研究院有限公司，动物使用许可证号：SYXK(冀)2015－0064。自由饮水摄食，环境温度(22±3)℃，相对湿度(50±5) %，12 h/12 h昼夜周期照明。卡托普利片购自中美上海施贵宝制药有限公司(国药准字H31022986)，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自美国罗氏公司，二奎啉甲酸(BCA)法蛋白定量试剂盒购自北京泰格美科技有限公司，ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38和p-p38抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)ELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。色多普勒超声诊断仪(型号Vivid i，美国GE公司)，光学显微镜(型号Eclipse 50i，日本Nikon公司)，电泳仪(型号GP200，托摩根生物科技有限公司)，酶标仪(型号Multiskan FC，美国赛默飞世尔公司)。

大鼠于造模前采用多普勒超声检查心脏，取心功能正常大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL·100 g^-1)麻醉，于左上腹切开上皮，暴露腹并结扎腹主动脉，使腹主动脉管腔形成50%环形缩窄，缝合切口，术后每天肌肉注射40万U青霉素，连续3 d。造模4周后，进行心脏彩超检测，以左室射血分数(left ventricular ejection fraction, LVEF) < 45%视为CHF大鼠模型制备成功。排除死亡大鼠后，共60只大鼠造模成功，将60只造模成功大鼠随机分为模型组、阳性对照组、低、中和高剂量三七总皂苷组，每组12只。另取12只大鼠作为假手术组。阳性对照组大鼠灌胃给予卡托普利(100 mg·kg^-1)^[10]；低、中和高剂量三七总皂苷组大鼠分别灌胃给予三七总皂苷(10、30和60 mg·kg^-1)^[11]; 假手术组和模型组大鼠分别灌胃给予等量生理盐水，连续给药8周，假手术组大鼠开腹后不结扎腹主动脉。观察各组大鼠一般情况。

末次给药后，麻醉大鼠，仰卧固定于鼠板，采用彩色多普勒超声仪检测各组大鼠左室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic diameter, LVEDD)、左室收缩末期内径(left ventricular end-systolic diameter, LVESD)、左室后壁舒张期厚度(left ventricular posterior wall diastolic thickness, LVPWD)和LVEF，连续检测3个心脏周期求得平均值。随后行右颈总动脉插管，将导管从右颈总动脉插入，逆向进入左心室，末端连接血压换能器，测定心输出量(cardiacoutput, CO)、左室舒张压(left ventricular diastolic pressure, LVEDP)、左室收缩压(left ventricular systolic pressuer, LVSP)、左心室压力最大上升速率(maximal rate of increase of left ventricular pressure, +dp/dt max)/左心室压力最大下降速率(maximal rate of decrease of left ventricular pressure, －dp/dt max)，连续检测3次取平均值。

取出固定心肌组织，常规制备石蜡切片(5 μm)，经烘烤、二甲苯脱蜡和梯度乙醇脱水后，HE染色，树脂封片后，置于光学显微镜下观察心肌组织病理形态表现。

将切片常规脱蜡水化，3%过氧化氢封闭10 min，加入蛋白酶37℃孵育20 min，山羊血清封闭20 min，加入50 μL TUNEL反应液，37℃孵育60 min，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次。加入5%辣根过氧化酶47℃孵育30 min，PBS清洗3次，二氨基联苯按(DAB)显色，苏木素复染，封片，显微镜下观察，随机取5个视野记录阳性细胞数和总细胞数，计算细胞凋亡率，细胞凋亡率=阳性细胞数/总细胞数×100%。

取各组大鼠心肌组织，加入600 μL RIPA裂解液，12 000 r·min^-1、4 ℃离心10 min，提取组织总蛋白，10% SDS-PAGE分离等量蛋白后进行转膜反应，5%脱脂奶粉封闭，添加抗ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38和β-actin抗体(1:500)，4 ℃过夜孵育，加入二抗(1:5 000)，室温摇床孵育1 h，采用ECL发光显影后置于凝胶成像仪内观察各蛋白表达，采用Image J软件对各蛋白条带进行量化分析。以β-actin作为内参，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值。

取大鼠腹主动脉血，室温下放置15 min后，2 500 r·min^-1离心10 min，分离血清，按照试剂盒说明书采用酶联免疫吸附法检测各组大鼠血清TNF-α和IL-6水平。

采用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析。大鼠LVEDD、LVESD、LVPWD、LVEF、CO、LVEDP、LVSP、+dp/dt max和-dp/dt max，各组大鼠心肌细胞凋亡率，各组大鼠心肌组织中ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38和p-p38蛋白表达水平，血清TNF-α和IL-6水平均符合正态分布，以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用独立样本t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

造模结束后，模型组大鼠死亡2只，死亡原因为CHF发作，假手术组、阳性对照组和低、中及高剂量三七总皂苷组大鼠未出现死亡。

与假手术组比较，模型组大鼠LVEDD、LVESD、LVPWD、LVEDP和-dp/dt max明显升高(P < 0.05)，LVEF、CO、LVSP和+dp/dt max明显降低(P < 0.05)；与模型组比较，阳性对照组和低、中及高剂量三七总皂苷组大鼠LVEDD、LVESD、LVPWD、LVEDP和-dp/dt max明显降低(P < 0.05)，LVEF、CO、LVSP和+dp/dt max明显升高(P < 0.05)。见表 1。

表 1 各组大鼠心脏功能指标 Tab. 1 Cardiac function indexes of rats in various groups 

()
Group	n	LVEDD(l/mm)	LVESD(l/mm)	LVPWD(l/mm)	LVEF(η/%)	CO(mL·min-1)
Sham opreation	12	5.04±0.36	3.02±0.26	1.13±0.12	64.23±6.17	66.25±7.78
Model	10	7.10±0.43*	4.01±0.31*	1.86±0.17*	44.27±4.19*	48.21±4.92*
Positive control	12	5.20±0.31△	3.09±0.29△	1.22±0.14△	60.17±5.80△	62.41±5.50△
Panax notoginseng saponins
Low dose	12	6.50±0.51△	3.62±0.23△	1.53±0.12△	49.82±5.01△	53.97±5.78△
Medium dose	12	5.98±0.62△	3.43±0.20△	1.49±0.14△	51.60±4.86△	56.20±4.82△
High dose	12	5.53±0.42△	3.24±0.28△	1.35±0.11△	55.34±5.24△	58.33±5.31△
Group	n	LVEDP(P/mmHg)		LVSP(P/mmHg)	+dp/dt max (mmHg·s-1)	-dp/dt max (mmHg·s-1)
Sham opreation	12	2.21±0.20		162.81±5.84	10.92±0.77	-16.93±0.62
Model	10	7.10±0.24*		143.31±6.86*	6.49±0.69*	-8.84±0.67*
Positive control	12	3.98±0.32△		159.74±7.20△	9.82±0.58△	-13.53±0.51△
Panax notoginseng saponins
Low dose	12	5.87±0.44△		151.20±5.31△	7.92±0.75△	-10.67±0.55△△
Medium dose	12	5.22±0.41△		152.21±7.20△	8.38±0.90△	-11.14±0.59△
High dose	12	4.06±0.39△		155.42±6.28△	9.01±0.65△	-13.31±0.60△
* P < 0.05 compared with sham operation group; △ P < 0.05 compared with model group.

表选项

假手术组大鼠心肌组织结构清晰，肌纤维排列整齐，细胞核大小一致。模型组大鼠心肌组织结构模糊，心肌细胞肥大，肌纤维排列紊乱，出现肌丝溶解、断裂，细胞核出现核碎裂、核溶解，可见大量炎性细胞浸润。与模型组比较，阳性对照组和低、中及高剂量三七总皂苷组大鼠心肌组织结构较完整，心肌细胞肥大减轻，心肌纤维排列较疏松，肌丝部分断裂，可见部分炎性细胞浸润。见图 1(插页七)。

A: Sham operation group; B: Model group; C: Positive control group; D-F:Low, medium, and high doses of panax notoginseng saponins groups 图 1 各组大鼠心肌组织形态表现（HE, ×200） Fig. 1 Morphology of myocardium tissue of rats in various groups (HE, ×200)

图选项

假手术组未见阳性心肌细胞，模型组可见大量阳性心肌细胞。与假手术组比较，模型组大鼠心肌细胞凋亡率明显升高(P < 0.05)；与模型组比较，阳性对照组和低、中及高剂量三七总皂苷组大鼠心肌细胞凋亡率明显降低(P < 0.05)。见图 2(插页八)。

A: Sham operation group; B: Model group; C: Positive control group; D-F:Low, medium, and high doses of panax notoginseng saponins groups. 图 2 各组大鼠心肌细胞凋亡形态表现（TUNRL, ×200） Fig. 2 Apoptotic morphology of myocardial cells of rats in various groups (TUNRL, ×200)

图选项

与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中p-ERK、p-JNK和p-p38蛋白表达水平明显升高(P < 0.05)；与模型组比较，阳性对照组和低、中及高剂量组大鼠胃癌组织中p-ERK、p-JNK和p-p38蛋白表达水平明显降低(P < 0.05)。各组大鼠胃癌组织中ERK、JNK和p-38蛋白表达水平比较无明显差异。见表 2和图 3。

表 2 各组大鼠心肌组织中p-ERK p-JNK和p-p38蛋白表达水平 Tab. 2 Expression levels of p-ERK, p-JNK, and p-p38 proteins in myocardium tissue of rats in various groups 

()
Group	n	p-ERK	p-JNK	p-p38
Sham operation	12	0.39±0.11	0.45±0.05	0.61±0.05
Model	10	1.61±0.23*	1.45±0.25*	1.78±0.21*
Positive control	12	0.98±0.19△	0.84±0.13△	0.85±0.09△
Panax notoginseng saponins
Low dose	12	1.33±0.25△	1.24±0.15△	1.32±0.11△
Medium dose	12	1.25±0.17△	1.20±0.17△	1.05±0.08△
High dose	12	1.08±0.20△	1.01±0.16△	0.76±0.10△
* P < 0.05 compared with sham operation group; △ P < 0.05 compared with model group.

表选项

Lane1:Sham operation group；Lane 2: Model group; Lane 3-5: Low, medium and high doses of panax notoginseng saponins groups；Lane 6: Positive control group. 图 3 各组大鼠心肌组织中ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38蛋白表达电泳图 Fig. 3 Electrophoregram of expressions of ERK, p-ERK, JNK, p-JNK, p38, and p-p38 proteins in myocardium tissue of rats in various groups

图选项

与假手术组比较，模型组大鼠血清TNF-α和IL-6水平明显升高(P < 0.05)；与模型组比较，阳性对照组、低、中及高剂三七总皂苷量组大鼠血清TNF-α和IL-6水平明显降低(P < 0.05)。见表 3。

表 3 各组大鼠血清TNF-α和IL-6水平 Tab. 3 Serum levels of TNF-α and IL-6 of rats in various groups 

[, ρB/(ng·L-1)]
Group	n	TNF-α	IL-6
Sham operation	12	80.45±7.65	38.24±3.61
Model	10	135.48±11.85*	60.50±5.89*
Positive control	12	98.36±10.85#	45.52±3.81△
Panax notoginseng saponins
Low dose	12	126.21±11.10△	52.33±4.62△
Medium dose	12	117.82±10.66△	51.04±5.47△
High dose	12	105.65±11.51△	48.99±4.05△
* P < 0.05 compared with sham operation group; △ P < 0.05 compared with model group.

表选项

引起CHF发生的基本机制是心肌重塑，而心肌细胞凋亡是CHF从代偿走向失代偿的转折点。研究^[12]表明:MAPKs信号通路激活是心肌细胞肥大和由收缩型向合成型演变的最后通路，参与心肌重构的过程。此外，参与心肌重塑的因素还有TNF-α、IL-1β和IL-6等细胞炎性因子^[13]。MAPKs是细胞中的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，存在于大多数细胞内，其作用是将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，从而引起细胞增殖、分化、转化和凋亡等反应^[14]。MAPKs是心肌细胞增殖、分化、凋亡、坏死、细胞骨架重组和间质纤维化等多条通路的汇聚点^[15]。ERK1/2、JNK和p38为MAPKs信号转导通路中最重要的3条亚通路。其中ERKl/2信号通路是经典MAPKs信号转导途径，参与细胞的生长、发育、增殖和分化等多种病理生理过程，是多种促增殖信号转导途径的共同通路。发生CHF时，在压力负荷增加的情况下，心脏牵张刺激、生长因子等与特异G蛋白偶联受体结合，激活蛋白激酶C，启动Ras-Raf-MEK-ERK途径，激活ERK1/2及其介导的信号通路，参与CHF的发展^[16]。JNK信号传导通路参与介导心功能不全期代偿性心肌肥厚，在心力衰竭期具有抗心肌细胞调亡作用^[17]。p38途径被认为是与细胞增殖、分化或凋亡调控密切相关的细胞信号转导途径，是细胞外信号引起细胞增殖、分化等核反应的共同途径或汇聚点。研究^[18]显示：p38信号转导通路被激活可能导致细胞在发生肥大过程后出现凋亡，在心力衰竭期具有促进心肌细胞凋亡作用。本研究结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠心肌细胞肥大、坏死，心肌纤维排列不规则，可见大量炎性细胞浸润，出现大量心肌细胞凋亡，表现为细胞质致密化、收缩变小，细胞片段化形成细胞凋亡体，心肌组织中p-ERK、p-JNK和p-p38蛋白表达水平明显增加；与模型组比较，阳性对照组和低、中及高剂量三七总皂苷组大鼠心肌细胞凋亡数明显减少，心肌细胞凋亡率明显降低，心肌组织中p-ERK、p-JNK和p-p38蛋白表达水平明显降低，以高剂量三七总皂苷组效果更明显，上述结果说明磷酸化是ERK、JNK和p38在心肌细胞内的蛋白后修饰方式，p-ERK、p-JNK及p-p38是参与相关生物学活动的重要形式，三七总皂苷可对ERK、JNK和p38的磷酸化产生抑制作用。

TNF-α是由激活的单核-巨噬细胞分泌的细胞因子，在机体免疫反应和炎症反应中作为重要递质，抑制心肌收缩力，导致左心室功能降低，产生急性水肿，血清TNF-α水平可作为判断心功能级别的一个重要指标^[19]。TNF-α可促进IL-6表达，这些细胞因子通过增强组织细胞对TNF-α的敏感性，使TNF-α的负性肌力作用进一步加强^[20]。IL-6作为一种多功能的细胞因子，主要有免疫调节、刺激造血和应激反应等作用^[21]。钱留军^[22]的研究表明：CHF患者血清中IL-6水平随病情加重而升高。本研究结果表明：三七总皂苷对CHF大鼠血清炎性细胞因子TNF-α和血清IL-6具有明显的抑制作用，以高剂量三七总皂苷的抑制效果最为显著。

综上所述，三七总皂苷可能通过下调CHF模型大鼠心肌组织中ERK、JNK和p38蛋白磷酸化，抑制血清炎性因子分泌，发挥抑制心肌细胞凋亡的作用。