自然杀伤(natural killer，NK)细胞是人体天然免疫系统的重要组成细胞，其能够杀伤肿瘤细胞^[1-2]。NK细胞治疗对血液肿瘤有很好疗效^[3]，对肺癌^[4]和肝癌^[5]也有一定临床疗效。研究^[6]表明：胃癌患者外周血中NK细胞数明显低于正常人，且NK细胞数与胃癌患者的临床病理分期有密切关联，NK细胞数越少，胃癌患者的临床病理分期越晚。胃癌患者NK细胞活化程度也明显低于正常人^[7]。有研究^[8]显示：如果能将胃癌患者外周血中NK细胞大量扩增激活，再回输患者，就有可能增加胃癌患者NK细胞数和改善其功能缺陷，提高胃癌患者的临床治疗效果。本研究旨在探讨扩增后NK细胞对胃癌细胞的杀伤作用及其机制，以期为NK细胞治疗胃癌提供理论依据。

SGC7901细胞购自北京北纳创联生物技术研究院，SGC7901细胞用含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的RPMI-1640培养基培养传代，每2~3 d换液1次。FBS和RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司，赫赛汀购自瑞士罗氏公司，重组人白细胞介素2(interleukin-2，IL-2)和重组人白细胞介素5(interleukin-5，IL-5)购自德国美天旎生物技术有限公司，X-VIVO培养基购自瑞士Lonza公司，淋巴细胞分离液购自挪威Nycomed Pharma AS公司，鼠抗人CD3-APC、CD56-PE、KIR2DL1-PE、KIR3DL1-APC、NKG2D-APC和DNAM-1-PE单克隆抗体购自美国BD Biosciences公司，人NK细胞富集试剂盒购自美国Stemcell Technologies公司，钙黄绿素购自日本同仁化学研究所。倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司，CO₂培养箱购自美国Thermo公司，离心机购自德国Beckman公司，流式细胞仪购自美国BD公司，酶标仪购自美国BioTeck公司。

收集15例胃癌患者的临床资料，其中男性8例，女性15例，年龄36~75岁，中位年龄58岁。根据TNM分期分为Ⅰ期7例，Ⅱ期5例，Ⅲ期3例。15例胃癌患者外周血经3 000 r·min^-1离心10 min，将血浆和血细胞分开，血浆置于56 ℃恒温培养箱中30 min以灭活补体，血细胞采用淋巴细胞分离液分离PBMCs，并采用生理盐水洗涤2次。

采用含有5%自体血浆、50 μg·L^-1赫赛汀、500 U·mL^-1重组人IL-2和10 μg·L^-1重组人IL-15的X-VIVO完全培养基将PBMCs密度调整至3×10⁶ mL^-1，接种于25 cm²培养瓶中，标记为培养第0天，并置于37 ℃、5% CO₂恒温培养箱中培养，每2~3 d半量更换1次X-VIVO培养基(含有5%自体血浆，500 U·mL^-1重组人IL-2和10 μg·L^-1重组人IL-15)。培养至第14天，收集细胞，开始后续实验。

在培养的第0、2、4、6、8、10、12和14天观察NK细胞的形态，记录培养液体积，取0.5 mL NK细胞培养基，进行细胞计数，将细胞密度调整为1×10⁶ mL^-1，取100 μL细胞加入至流式管中，加入CD3-APC和CD56-PE单克隆抗体，室温下避光孵育15 min，PBS洗涤2次，100 μL PBS悬起细胞，采用流式细胞术检测NK细胞百分比。按照0.5 mL培养基中细胞数计算培养基中细胞总数，并根据流式细胞术检测的NK细胞百分比计算NK细胞实际数。

采用人NK细胞富集试剂盒分离PBMCs中的NK细胞和扩增培养后的NK细胞。

将细胞按照靶细胞和效应细胞比例不同分为实验组、最小释放组和最大释放组。靶细胞处理：收集培养的SGC7901细胞，以PBS洗涤1次，并采用PBS将其密度调整至1×10⁶ mL^-1，取1 mL细胞，加入钙黄绿素，使其终浓度为1 μmol·L^-1，置于37 ℃、5%CO₂培养箱中孵育30 min。PBS洗涤2次后，采用含5% FBS的RPMI-1640培养基重悬细胞，并将细胞密度调整至5×10⁴ mL^-1。效应细胞处理：将纯化的NK细胞采用含有5% FBS的RPMI-1640培养基重悬细胞，并将其密度调整至5×10⁵ mL^-1(5:1)。实验组：加入100 μL靶细胞和效应细胞，加入圆底无菌带盖96孔板中；最小释放组：加入100 μL靶细胞和100 μL PBS；最大释放组：100 μL靶细胞和100 μL含有10%TritonX-100的PBS；每组3个复孔。在37℃、5%CO₂培养箱中避光孵育4 h。从每孔中轻轻吸取100 μL上清置于新的平底96孔平板中。采用酶标仪检测上清的荧光值(激发光波长为485 nm，发射光波长为528 nm)，计算扩增前后NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。杀伤活性=(实验组荧光值－最小释放组荧光值)/(最大释放组荧光值－最小释放组荧光值)×100%。

收集细胞，以PBS洗涤1次，并采用PBS将其密度调整至1×10⁶ mL^-1，取100 μL细胞加入流试管中，加入CD3-PerCP和CD56-FITC单克隆抗体，同时分别加入KIR2DL1-PE、KIR3DL1-APC、NKG2D-APC和DNAM-1-PE单克隆抗体及其同型对照抗体，避光孵育15 min后，PBS洗涤1次，100 μL PBS重悬细胞，采用流式细胞术进行检测。采用FlowJo Version 10软件分析流式细胞术检测结果进行表型分析。

5.01软件分析数据，扩增前后NK细胞百分比、NK细胞对胃癌细胞的杀伤活性、NK细胞表面活化性受体表达和表面抑制性受体表达百分比均以x ±s表示，组间比较采用配对t检验。以P < 0.05表示差异有统计学意义。

培养第0天PBMCs中NK细胞呈圆形，细胞体积比较小，细胞散在分布，偶见细胞集落；培养第3天，PBMCs中NK细胞出现明显聚集，呈克隆样生长；培养第7天，PBMCs中NK细胞体积增大，有些细胞形态不规则；培养第14天，不规则形态NK细胞数明显增多。见图 1 (插页六)。

A: Before expansion; B: 14 d after expansion. 图 1 扩增前后NK细胞形态表现 Fig. 1 Morphology of NK cells before and after expansion

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15例胃癌患者中1例代表性胃癌患者扩增前外周血中NK细胞百分比仅为14.1%(图 2A)，经过14 d扩增后，NK细胞百分比达到89.6%(图 2B)。全部15例胃癌患者扩增前外周血中NK细胞百分比为(16.25±6.84)%；经过14 d扩增后，NK细胞百分比为(80.57±9.36)%(图 2C)。扩增后NK细胞百分比明显高于扩增前(P < 0.01)。

A:Percentage of NK cells before expansion(from one patient); B: Percentage of NK cells after expansion(from one patient); C: Proportion graph of NK cells before and after expansion (from fifteen patients). 图 2 胃癌患者体外扩增前后NK细胞百分比 Fig. 2 Percentages of NK cells of patient with gastric cancer before and after amplification in vitro

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在体外扩增NK细胞的过程中，扩增前4 d，NK细胞增殖较慢；扩增第6天，NK细胞数明显增加；扩增第10天开始，NK细胞增殖速度呈线性增长，该阶段是NK细胞大量扩增期, 在体外扩增第14天，NK细胞数是扩增前的(596±152)倍。见图 3(每条线代表1例患者NK细胞体外扩增时NK细胞数的变化趋势)。

图 3 扩增过程中NK细胞增殖曲线 Fig. 3 Proliferation curres of NK cells during expansion

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分离胃癌患者PBMCs中扩增前后NK细胞，检测扩增前后NK细胞对胃癌细胞的杀伤活性。在效靶比为5:1时，扩增后NK细胞对胃癌细胞的杀伤活性(27.99%±6.39%)明显强于扩增前(12.32%±4.85%)(P < 0.01)。见图 4。

图 4 扩增前后NK细胞对胃癌细胞的杀伤活性 Fig. 4 Killing activities of NK cells against gastric carcinoma cells before and after expansion

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扩增后NK细胞表面活化性受体NKG2D(82.44%±15.57%)和DNAM-1(86.86%±11.91%)表达百分比明显高于扩增前(72.18%±13.98%和67.95%±15.01%，P < 0.01)。扩增后NK细胞表面抑制性受体KIR2DL1(18.65%±8.42%)和KIR3DL1(16.84%±7.92%)表达百分比明显低于扩增前(29.08%±12.41%和20.97%±9.48%，P < 0.01)，表明扩增后NK细胞是活化程度更高的NK细胞。见图 5和图 6。

A, C: Flow cytometry diagram; B, D: Scatter plot; A, B:Expression of NKG2D;C, D: Expression of DNAM-1. 图 5 扩增前后NK细胞表面活化性受体表达 Fig. 5 Expressions of activating receptors of NK cells before and after amplification

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A, C: Flow cytometry diagram; B, D: Scatter plot; A, B:Expression of KIR2DL1;C, D: Expression of KIR3DL1. 图 6 扩增前后NK细胞表面抑制性受体表达 Fig. 6 Expressions of inhibitory receptors of NK cells before and after amplification

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近年来，肿瘤的NK细胞疗法取得了较大进展^[9-11]。NK细胞扩增方法主要有2种，一种是滋养层法，一种是细胞因子法^[12]。滋养层法即采用致死剂量辐照的肿瘤细胞作为滋养层细胞刺激NK细胞增殖^[13-15]。滋养层法虽然能够在短时间内获得大量、高纯度NK细胞，但是因为这种方法中加入了肿瘤细胞，存在肿瘤细胞继续增殖的风险，因此限制了该方法的临床应用。细胞因子法即采用细胞因子刺激NK细胞增殖^[16-19]，该方法去除了滋养层细胞成瘤的风险，且在一定的时间内也能获得大量、高纯度NK细胞，可以满足临床治疗需要。本研究将单克隆抗体和细胞因子联合来扩增NK细胞，经过14 d培养，NK细胞数能够满足临床治疗的需要，且扩增的NK细胞对胃癌细胞的杀伤作用明显强于胃癌患者外周血中的NK细胞，表明扩增的NK细胞可以用于胃癌的临床治疗。

NK细胞对肿瘤细胞杀伤可以通过3条途径：①分泌细胞毒性物质，包括穿孔素和颗粒酶；②分泌细胞因子，包括干扰素γ(interferon-γ，IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等；③通过抗体依赖细胞介绍的细胞毒作用^[20-23]。NK细胞抗肿瘤作用的发挥受到其表面活化分子和抑制分子的调控作用^[24]。当活化信号强于抑制信号时，NK细胞被活化，进而发挥抗肿瘤作用^[25-26]。本研究结果显示：扩增后NK细胞表面活化性受体NKG2D和DNAM-1表达明显高于扩增前，而抑制性受体KIR2DL1和KIR3DL1表达明显低于扩增前；本文作者发现：扩增后NK细胞对胃癌细胞的杀伤作用明显强于扩增前，这可能与扩增后NK细胞表面活化性受体增多而抑制性受体减少有关。当扩增的NK细胞与肿瘤细胞接触时，高表达的活性受体能够与其配体相互作用，并向NK细胞传递更多的活化信号，进而激活NK细胞，使NK细胞的抗肿瘤活性增强。

综上所述，经体外扩增后，NK细胞对胃癌细胞的杀伤活性明显增强，这可能与扩增的NK细胞表面活化性配体的表达升高、抑制性配体表达降低有关。本研究明确了扩增的NK细胞对胃癌细胞的杀伤作用及可能机制，为NK细胞治疗胃癌提供了理论基础。