2020, Vol. 46扩展功能
文章信息
- 王映映, 孙利娟, 范紫微, 古虹, 游先梅, 关天昊, 张成义, 陈曦
- WANG Yingying, SUN Lijuan, FAN Ziwei, GU Hong, YOU Xianmei, GUAN Tianhao, ZHANG Chengyi, CHEN Xi
- 黄芩苷对脂多糖诱导的大鼠滑膜RSC-364细胞自噬的抑制作用
- Inhibitory effect of baicalin on autophagy of synovial RSC-364 cells of rats induced by lipopolysaccharide
- 吉林大学学报(医学版), 2020, 46(03): 498-503
- Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2020, 46(03): 498-503
- 10.13481/j.1671-587x.20200311
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文章历史
- 收稿日期: 2019-09-12
2. 北华大学药学院药理教研室, 吉林 吉林 132013;
3. 北华大学医学院医学影像学教研室, 吉林 吉林 132013;
4. 北华大学医学技术学院医学检验技术教研室, 吉林 吉林 132013
2. Department of Pharmacology, College of Pharmacy, Beihua University, Jilin 132013, China;
3. Department of Medical Imageology, College of Medical Sciences, Beihua University, Jilin 132013, China;
4. Department of Medical Laboratory Technology, College of Medical Technology, Beihua University, Jilin 132013, China
黄芩苷是一种黄酮类化合物，主要来源于黄芩干根[1-2]。目前的研究[3-4]表明：黄芩苷具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤等作用。WANG等[5]已证实：在胶原诱导的关节炎大鼠中，黄芩苷能减少滑膜组织和滑膜成纤维细胞中核因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)蛋白表达，减轻关节炎症。在关节炎小鼠模型中，黄芩苷可明显减轻踝关节肿胀[6]。在类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)发病机制中, 类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(rheumatoid arthritis synovial fibroblasts，RASFs)起重要作用[7]。RASFs能够产生大量炎性细胞因子、趋化因子和基质降解酶，从而促进RA炎症和关节破坏状态[8]。研究[9]显示：RA疾病严重程度与滑膜组织自噬水平呈正相关关系。因此，自噬可能是RA的潜在治疗靶点。目前，黄芩苷对RA滑膜细胞自噬的影响尚未见相关报道。有研究[10]显示：磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素(PI3k/Akt/mTOR)信号传导途径与RA发生发展有关。本研究观察PI3k/Akt/mTOR信号通路对脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)诱导的大鼠滑膜RSC-364细胞自噬的影响，探讨黄芩苷抗炎分子机制，为RA的临床治疗提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 细胞、主要试剂和仪器大鼠滑膜RSC-364细胞购于北京鼎国生物技术有限公司，采用含10%胎牛血清的DMEM完全培养液培养，于37℃、5%CO2培养箱中培养。LPS和ECL底物化学发光液购于北京鼎国生物技术有限公司；DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)和噻唑蓝(MTT)购于美国Sigma公司；黄芩苷购于西安瑞芬生物工程有限公司，黄芩苷溶解于完全培养基中配制成40 μmol·L-1储存液；逆转录cDNA试剂盒和高纯度总RNA快捷提取试剂盒购于美国BioTake公司；β-actin多克隆抗体(ab8227)、Beclin1 (ab62557)、微管相关蛋白-轻链3-Ⅱ(microtubule-associated protein-light chain3-Ⅱ, LC3-Ⅱ)(ab48394)和HRP标记二抗(ab205718)均购自英国Abcam公司；Atg5(A0203)、Atg7(A0691)、Atg12(A17045)和P62(A7758)均购自中国武汉AB clonal公司。Bio-Rad 680酶标仪购于美国Bio-Rad公司，E-Gellmager凝胶成像系统购于美国Thermo公司，Eppendorf-PCR仪购于德国Eppendorf公司，JY200C通用型电泳仪购于上海珂淮仪器有限公司。
1.2 实验分组和MTT法检测各组RSC-364细胞存活率采用含10%胎牛血清的DMEM完全培养液培养RSC-364细胞，取处于对数生长期RSC-364细胞，以细胞密度1.0 ×104 mL-1接种于96孔细胞培养板，每组设置6个复孔，每孔接种200 μL，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，分为对照组，模型组，地塞米松(DXMS)组，10、20和40 μmol·L-1黄芩苷组。对照组RSC-364细胞只加入细胞培养基，其他各组RSC-364细胞均给予1 mg·L-1 LPS诱导其炎症反应, 培养12 h后, 黄芩苷组RSC-364细胞分别加入10、20和40 μmol·L-1黄芩苷，DXMS组RSC-364细胞给予终浓度为0.5 μmol·L-1 DXMS，继续孵育24 h后，每孔加入20 μL MTT溶液于培养箱中培养4 h。随后弃去上清液，每孔加入150 μL DMSO，混匀10 min后，在490 nm处检测吸光度(A)值并记录结果，所测A值越小，则存活细胞数就越少。细胞存活率＝给药组A值/对照组A值× 100%。
1.3 RT-PCR法检测各组RSC-364细胞中PI3k、Akt、mTOR、Beclin1、Atg5、Atg7、Atg12和LC3-Ⅱ mRNA表达水平采用RNA提取试剂盒提取各组大鼠滑膜RSC-364细胞总RNA。采用逆转录cDNA试剂盒(BioTake)以总RNA为模板，进行逆转录cDNA；RT-PCR反应体系(25 μL)包括：2 Taq Master Mix 12.5 μL、双蒸水9.5 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL和cDNA1 μL。PCR扩增以逆转录cDNA为模板，在94℃、3 min条件下进行初始变性，经过20个循环，94℃、30 s变性，65℃、30 s退火和72℃、1 min延伸过程，72℃、10 min充分延伸；其次点样，100 V、40 min电泳，采用ImageJ6.0软件分析扩增后的琼脂糖凝胶电泳条带灰度值，进行目的基因mRNA半定量分析，计算各组RSC-364细胞中PI3k、Akt、mTOR、Beclin1、Atg5、Atg7、Atg12和LC3-Ⅱ mRNA表达水平。目的基因mRNA表达水平=目的基因条带灰度值/内参GAPDH条带灰度值。以上实验至少重复3次。RT-PCR引物序列见表 1。
| Primer | Primer sequence (5′-3′) | Fragment length (bp) |
| Atg5 | Forward: TGTGATCCCGGTAGACCCAA Reverse: AAACCACACGTCTCGAAGCA |
170 |
| Atg7 | Forward: GGTGAGGGGACTGGACTTTTA Reverse: GCACCAACTCTGCTGTTCTC |
264 |
| Atg12 | Forward: GCTGAAGGCTGTAGGAGACA Reverse: CATCCCCATGCCTGTGATTTG |
249 |
| PI3k | Forward: GTGGACACCCAAGCTGACTG Reverse: AAGCAAATCCCTTCACCCCAA |
179 |
| Akt | Forward: GGAGTGTGTGGACAGTGAACG Reverse: TCAGGTACAGATGATCCATGCG |
150 |
| mTOR | Forward: CAGAGGTGTGGTTTGACCGA Reverse: CAGCATCAGGTTGGATGGGT |
110 |
| Beclin1 | Forward: AACTCTGGAGGTCTCGCTCT Reverse: CGCCTTAGACCCCTCCATTC |
109 |
| LC3-Ⅱ | Forward: TCCCAAGAAACCTTCGGCTT Reverse: CCAGCACCCAAAAGAGCAAG |
231 |
| GAPDH | Forward: GGCAAGTTCAACGGCACAG Reverse: GCCAGTAGACTCCACGACAT |
124 |
细胞裂解缓冲液、PMSF和磷酸酶抑制剂配置工作液，用于滑膜RSC-364细胞总蛋白的提取。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒对蛋白质进行定量分析。具体方法：配胶，浓缩胶、分离胶(12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶)；上样，各组取50 μg样本蛋白；电泳，浓缩胶80V、30 min，分离胶100 V、1.5 h；转模，PVDF膜，100 V、1 h；封闭，5%脱脂奶粉，室温封闭1 h；孵育一抗，4℃过夜。采用TBST稀释兔抗大鼠抗体、Atg5、Atg7、Atg12、LC3-Ⅱ、Beclin1、P62和β-actin；回收一抗，TBST进行洗膜3次，每次10 min；孵育二抗：HRP标记山羊抗兔IgG(1:10 000稀释)室温1 h，TBST洗3次，每次10 min；采用增强化学发光底物试剂盒进行免疫检测。以β-actin作为蛋白内参对照，采用ImageJ6.0软件对特异蛋白条带的灰度值进行定量分析, 计算各组RSC-364细胞中Beclin1、Atg5、Atg7、Atg12、LC3-Ⅱ和P62蛋白表达水平。目的蛋白表达水平＝目的蛋白条带灰度值/内参β-actin条带灰度值。以上实验至少重复3次。
1.5 统计学分析所有数据均采用Graphpad Prism 5.0软件进行统计学分析。各组RSC-364细胞存活率，RSC-364细胞中PI3k、Akt、mTOR、Beclin1、Atg5、Atg7、Atg12和LC3-Ⅱ mRNA及Beclin1、Atg5、Atg7、LC3-Ⅱ和P62蛋白表达水平均以x ±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用SNK-q检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组RSC-364细胞存活率与对照组比较，模型组RSC-364细胞存活率明显升高(P < 0.01)；与模型组比较，不同浓度黄芩苷组RSC-364细胞存活率明显降低(P < 0.05或P < 0.01)。见图 1。
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| 1:Control group; 2:Model group; 3:DXMS group; 4:10 μmol·L-1 baicalin group; 5:20 μmol·L-1 baicalin group; 6:40 μmol·L-1 baicalin group; *P < 0.01 compared with control group; △P < 0.05, △△P < 0.01 compared with model group. 图 1 MTT法检测各组RSC-364细胞存活率MTT法检测各组RSC-364细胞存活率 Fig. 1 Survival rates of RSC-364 cells in various groups detected by MTT assay |
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与对照组比较，模型组RSC-364细胞中PI3k、Akt和mTOR mRNA表达水平明显降低(P < 0.05)，Beclin1、Atg5、Atg7、Atg12和LC3-Ⅱ mRNA表达水平升高(P < 0.05或P < 0.01)；与模型组比较，不同浓度黄芩苷组RSC-364细胞中PI3k、Akt和mTOR mRNA表达水平明显升高(P < 0.05或P < 0.01)，Beclin1、Atg5、Atg7、Atg12及LC3-Ⅱ mRNA表达水平明显降低(P < 0.05或P < 0.01)；不同浓度黄芩苷组RSC-364细胞中上述指标比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。见图 2和图 3。
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| Lane1: Control group; Lane 2: Model group; Lane 3: DXMS group; Lane 4-6:10, 20, and 40 μmol·L-1 baicalin groups. 图 2 各组RSC-364细胞中PI3k、Akt、mTOR、Atg5、Atg7、Atg12、Beclin1和LC3-Ⅱ mRNA表达电泳图 Fig. 2 Electrophoregram of expressions of PI3k, Akt, mTOR, Atg5, Atg7, Atg12, Beclin1, and LC3-Ⅱ mRNA in RSC-364 cells in various groups |
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| A:Expression levels of PI3K, mTOR, and Atg5 mRNA; B:Expression levels of Atg7, Atg12, Beclin1, and LC3-Ⅱ mRNA; 1:Control group; 2:Model group; 3:DXMS group; 4-6:10, 20, and 40 μmol·L-1 baicalin groups.*P < 0.01 compared with control group; △P < 0.05, △△P < 0.01 compared with model group. 图 3 各组RSC-364细胞中PI3k、Akt、mTOR、Beclin1、Atg5、Atg7、Atg12和LC3-Ⅱ mRNA表达水平 Fig. 3 Expression levels of PI3k, Akt, mTOR, Atg5, Atg7, Atg12, Beclin1, and LC3-Ⅱ mRNA in RSC-364 cells in various groups |
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与对照组比较，模型组RSC-364细胞中LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg5、Atg7和Atg12蛋白表达水平明显升高(P < 0.01)，P62蛋白表达水平降低(P < 0.01)；与模型组比较，不同浓度黄芩苷组RSC-364细胞LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg5、Atg7和Atg12蛋白表达水平明显降低(P < 0.05或P < 0.01)，P62蛋白表达水平升高(P < 0.05或P < 0.01)；不同浓度黄芩苷组RSC-364细胞中上述指标比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。见图 4和图 5。
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| Lane 1: Control group; Lane 2: Model group; Lane 3: DXMS group; Lane 4-6:10, 20, and 40 μmol L-1 baicalin groups. 图 4 Western blotting法检测各组RSC-364细胞中Atg5、Atg7、Atg12、Beclin1、LC3-Ⅱ和P62蛋白表达电泳图 Fig. 4 Electrophoregram of expressions of Atg5, Atg7, Atg12, Beclin1, LC3-Ⅱ, and P62 proteins in RSC-364 cells in various groups detected by Western blotting method |
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| A:Expression levels of Atg5, Atg7, and Atg12 proteins; B:Expression levels of Beclin1, LC3-Ⅱ, and P62 proteins; 1:Control group; 2:Model group; 3:DXMS group; 4－6:10, 20, and 40 μmol·L-1 baicalin groups; *P < 0.01 compared with control group; △P < 0.05, △△P < 0.01 compared with model group. 图 5 各组RSC-364细胞中Atg5、Atg7、Atg12、Beclin1、LC3-Ⅱ和P62蛋白表达水平 Fig. 5 Expression levels of Atg5, Atg7, Atg12, Beclin1, LC3-Ⅱ, and P62 proteins in RSC-364 cells in various groups |
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RA是一种因免疫耐受机制而产生的慢性变态反应性疾病[11]，其主要特征为滑膜增生和炎性细胞浸润。研究[7]已证实：RASFs大量增殖是RA发病的关键因素之一。近年来，常采用体外培养大鼠滑膜RSC-364细胞经LPS诱导，促使细胞增殖并分泌大量炎性因子作为细胞水平炎症模型。本研究结果显示：LPS诱导后，模型组RSC-364细胞大量增殖；给予黄芩苷后，LPS诱导的RSC-364细胞存活率明显降低，其增殖明显受到抑制，提示黄芩苷可抑制LPS诱导的RSC-364细胞增殖；与相关文献[12]报道的结果一致。
自噬是生物体中进化保守的溶酶体降解的途径[13]，其能调控细胞存活、增殖和凋亡等，以维持细胞内平衡。自噬失调与其自身免疫性疾病发病机制有关[14]，RA发病过程中存在自噬途径的失调。研究[9]显示：RASFs通过各种途径激活自噬，以维持细胞内环境稳定，促使滑膜细胞的大量增殖，导致关节炎症反应加重。
PI3k/Akt/mTOR信号通路在细胞自噬中发挥着重要作用[10]。PI3k和Akt是mTOR重要的上游调控因子，PI3k可以激活Akt，活化的Akt进一步磷酸化mTOR[15]。mTOR作为自噬启动阶段的关键调节因子，活化后可抑制自噬的发生[16]。Beclin 1是启动自噬的关键，在哺乳动物细胞中，Beclin 1表达上调可以激活自噬[17]。Atg5和Atg7对自噬小体的延伸起重要作用，Atg7启动Atg5- Atg12结合以及LC3-Ⅰ脂化反应形成LC3-Ⅱ [12, 18]。P62水平经常被用作自噬活动的标志，其充当信号转导分子和自噬选择性底物，连接多泛素化蛋白及其相关蛋白细胞器到自噬体进行降解[19]。
本研究结果显示：模型组RSC-364细胞中PI3k、Akt和mTOR mRNA表达水平降低，Atg5、Atg7、Atg12、Beclin1和LC3-ⅡmRNA及蛋白表达水平升高，P62蛋白表达水平较低，提示LPS诱导的RSC-364细胞中可通过抑制PI3k/Akt/mTOR信号通路激活自噬；给予黄芩苷后，黄芩苷组RSC-364细胞中自噬通路PI3k、Akt和mTOR mRNA表达水平升高，Atg5、Atg7、Atg12、Beclin1和LC3-ⅡmRNA及蛋白表达水平降低，P62蛋白表达水平升高，提示黄芩苷可通过促进PI3k/Akt/mTOR信号通路抑制LPS诱导的RSC-364细胞自噬。
综上所述，黄芩苷可能通过激活PI3k/Akt /mTOR信号通路抑制LPS诱导的RSC-364细胞自噬，从而抑制炎性RSC-364细胞增殖。
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