吉林大学学报(医学版)  2020, Vol. 46 Issue (03): 464-469     DOI: 10.13481/j.1671-587x.20200306

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徐凤英, 刘儒, 马丽, 曲一帆, 肖伟利, 王玉珍, 谢基明
XU Fengying, LIU Ru, MA Li, QU Yifan, XIAO Weili, WANG Yuzhen, XIE Jiming
乳腺癌MDA-MB-231细胞中Rab7a基因的网络分析
Network analysis on Rab7a gene in breast cancer MDA-MB-231 cells
吉林大学学报(医学版), 2020, 46(03): 464-469
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2020, 46(03): 464-469
10.13481/j.1671-587x.20200306

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收稿日期: 2019-06-04
乳腺癌MDA-MB-231细胞中Rab7a基因的网络分析
徐凤英1 , 刘儒1 , 马丽1 , 曲一帆1 , 肖伟利2 , 王玉珍3 , 谢基明2     
1. 内蒙古医科大学研究生学院, 内蒙古 呼和浩特 010110;
2. 内蒙古自治区人民医院检验科, 内蒙古 呼和浩特 010010;
3. 内蒙古农业大学生命科学学院, 内蒙古 呼和浩特 010018
[摘要]: 目的 探讨三阴性乳腺癌(TNBC)MDA-MB-231细胞中Rab7a基因敲除后相关基因表达的变化,阐明Rab7a相关基因在TNBC中的作用。方法 选取对数生长期的乳腺癌ZR-75-30、MCF-7、T-47D、MDA-MB-231和HCC-1937细胞,采用Western blotting法检测乳腺癌ZR-75-30、MCF-7、T-47D、MDA-MB-231和HCC-1937细胞中Rab7a蛋白表达水平。慢病毒敲除TNBCMDA-MB-231细胞中Rab7a基因,分为阴性对照组和Rab7a基因敲除组,根据敲除的4种不同Rab7a序列分为KD1组、KD2组、KD3组和KD4组。采用qPCR法检测各组MDA-MB-231细胞中Rab7a基因敲除效率,全基因表达谱芯片检测Rab7a基因敲除效率最高组(KD2组)和阴性对照组差异基因,一体化通路分析(IPA)软件分析Rab7a基因与其他基因的相互作用。结果 在TNBCMDA-MB-231细胞中可见Rab7a蛋白表达。与阴性对照组比较,KD2组乳腺癌MDA-MB-231细胞中Rab7a基因敲除效率最高(P < 0.01);与阴性对照组比较,KD2组乳腺癌MDA-MB-231细胞中有634个差异基因,其中上调基因和下调基因数均增多(P < 0.01);差异基因分析,Rab7a基因敲除与癌症、细胞存活、细胞周期和细胞生长及转移等有密切联系;Rab7a的IPA网络图中eIF4F、IRS1和RPS6KB1表达下调,PRKAA1、IKBKE、VEGFA和转录因子ATF2表达上调。结论 Rab7a基因在TNBCMDA-MB-231细胞中以基因网络的形式发挥作用;Rab7a基因与多基因相互作用,参与癌细胞的病理过程。
关键词: 乳腺肿瘤    Rab7a    三阴性乳腺癌    MDA-MB-231细胞    一体化通路分析    
Network analysis on Rab7a gene in breast cancer MDA-MB-231 cells
XU Fengying1 , LIU Ru1 , MA Li1 , QU Yifan1 , XIAO Weili2 , WANG Yuzhen3 , XIE Jiming2     
1. Graduate School, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, China;
2. Department of Clinical Laboratory, People's Hospital, Inner Mongolia Autonomons Region, Hohhot 010010, China;
3. College of Life Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China
[ABSTRACT]: Objective To investigate the changes of expressions of the related genes in the triple-negative breast cancer(TNBC) MDA-MB-231 cells after knockout of Rab7a gene, and to elucidate the roles of Rab7a-related genes in TNBC. Methods The breast cancer ZR-75-30, MCF-7, T-47D, MDA-MB-231 and HCC-1937 cells in the logarithmic phase were selected.The expression levels of Rab7a protein in the breast cancer ZR-75-30, MCF-7, T-47D, MDA-MB-231, and HCC-1937 cells were detected by Western blotting method. The Rab7a gene in the MDA-MB-231 cells was knockout with lentivirus and the cells were divided into negative control group and Rab7a knockout group. According to the four different knockout Rab7a sequences, the Rab7a knockout group was divided into KD1 group, KD2 group, KD3 group and KD4 group. The knockout efficiencies of Rab7a gene in the MDA-MB-231 cells in various groups were detected by qPCR method, the differential genes in the highest knockout efficiency group (KD2 group) and negative control group were detected by full gene expression microarray, and the interaction between Rab7a gene and other genes was analyzed by integrated pathway analysis (IPA) software. Results The Rab7a protein was expressed in the TNBC MDA-MB-231 cells. Compared with negative control group, the knockout efficiency of Rab7a gene in the MDA-MB-231 cells in KD2 group was the highest (P < 0.01); compared with negative control group, there were 634 differential genes in the MDA-MB-231 cells in KD2 group, the number of up-regulated genes and down-regulated genes were increased(P < 0.01); the differential gene analysis results showed that Rab7a knockout had the relationships with cancer, cell survival, cell cycle, cell growth, and migration. The expressions of eIF4F, IRS1 and RPS6KB1 in the Rab7a IPA network diagram were down-regulated, and the expressions of PRKAA1, IKBKE, VEGFA, and transcription factor ATF2 were up-regulated. Conclusion Rab7a gene plays a role as a gene network in the TNBC MDA-MB-231 cells. The Rab7a gene interacts with the multiple genes and participates in the pathological processes of cancer cells.
KEYWORDS: breast neplasom    Rab7a    triple-negative breast cancer    MDA-MB-231 cells    Ingenuity Pathway Analysis    

Rab7a基因和Rab7b基因是Rab7基因家族的2个同源亚型,具有较高的序列相似性[1]。与负责从核内体向高尔基体转运的Rab7b不同[2],Rab7a位于晚期核内体,控制向内吞降解室的转运[3]。Rab7a是溶酶体、吞噬体和自噬体成熟所必需的,并已被证明可调节细胞的存活和凋亡。最近报道[4]表明:Rab7a在癌症中也发挥了重要作用。波形丝蛋白是反映上皮间质转化的一个指标[5],在癌细胞中由Rab7a调控[6]。伏立诺和辛伐他汀可通过抑制Rab7协同抑制三阴性乳腺癌(tripe-negative breast cancer, TNBC)的发展[7]。然而目前尚未见关于Rab7a相关联基因如何参与TNBC发生发展的报道。本研究利用慢病毒载体敲除TNBC MDA-MB-231细胞中Rab7a基因,通过与阴性对照组比较,对差异基因进行分析,推断Rab7a及其关联基因的相互作用以及其可能参与的重要病理过程。

1 材料与方法 1.1 细胞、病毒、主要试剂和仪器

人乳腺癌ZR-75-30、T-47D、HCC-1937、MDA-MB-231和MCF-7细胞购自美国模式菌种收集中心(American Type Culture Collection, ATCC)。慢病毒lv-Rab7a-sgRNA和阴性对照CON251购自上海吉凯基因化学技术有限公司。DMEM培养基购自美国Invitrogen公司,Ausbian胎牛血清(FBS)购自上海威正翔禹生物科技有限公司,BCA试剂盒和RIPA裂解液均购自上海碧云天生物有限公司。anti-Rab7a和anti-GAPDH均购自美国Santa Cruz公司,TRIzol试剂盒购自上海普飞公司,M-MLV反转录试剂盒、dNTP和Rnase Inhibitor均购自北京Promega公司,SYBR Master Mixture购自日本TaKaRa公司,人基因表达谱芯片(货号:901838)、安捷伦RNA 6000 Nano试剂盒、3′IVT PLUS基因芯片和基因芯片杂交洗涤染色试剂盒均购自美国Affymetrix公司。

1.2 细胞培养

人乳腺癌ZR-75-30、T-47D和HCC-1937细胞置于RPMI1640培养基中培养,乳腺癌MCF-7细胞采用DMEM培养基培养,MDA-MB-231细胞采用L-15培养基培养。培养基中血清含量均为10%。MDA-MB-231细胞隔天换液1次,当细胞生长至80%~90%融合时,采用含EDTA的PBS平衡盐溶液漂洗,再采用0.25%胰蛋白酶消化传代,均在37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.3 Western blotting法检测乳腺癌ZR-75-30、MCF-7、T-47D、MDA-MB-231和HCC-1937细胞中Rab7a蛋白表达水平

收集对数生长期目的细胞,提取总蛋白,采用BCA试剂盒测定蛋白水平。取50 μg蛋白样品按比例加入上样缓冲液,沸水浴5 min,冷却离心后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),采用湿转法120 V、90 min将蛋白质电转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,然后采用磷酸盐缓冲液和吐温20 (TBST)溶解的5%脱脂奶粉室温封闭4 h,阻断与抗体的非特异性结合。膜与一抗(1:1 000) 4℃孵育过夜,次日采用TBST洗涤3次(每次10 min),室温孵育辣根过氧化物酶标记的二抗(1:10 000) 2 h,TBST洗涤3次(每次10 min)后检测PVDF膜上Rab7a蛋白表达水平。

1.4 慢病毒载体介导的Rab7a基因敲除

将处于对数生长期的MDA-MB-231细胞经胰酶消化,完全培养基制成细胞密度为(3~5)×104mL-1的细胞悬液,取2 mL接种于6孔板,培养24 h后,采用感染复数(MOI)为10的慢病毒感染MDA-MB-231细胞以敲除Rab7a基因,培养12 h后采用完全培养液代替病毒感染液继续培养。慢病毒载体上的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)表达率为90%时,收集细胞进行后续Rab7a基因敲除效率的验证。Rab7a基因敲除组根据敲除的4种不同Rab7a基因序列分为KD1组、KD2组、KD3组和KD4组,并设置阴性对照组。各组Rab7a基因敲除序列见表 1

表 1 各组Rab7a基因敲除序列 Tab. 1 Knockout sequences of Rab7a gene in various groups
GroupSequence (5′-3′)
Negtive controlTTCTCCGAACGTGTCACGT
KD1ACGAATTTCCTGAACCTAT
KD2AACAAGATTGACCTCGAAA
KD3CACAATAGGAGCTGACTTT
KD4CATTTGTTGTGTTGGGAAA
1.5 qPCR法检测各组乳腺癌MDA-MB-231细胞中Rab7a基因敲除效率

采用TRIzol试剂盒对病毒感染的各组乳腺癌MDA-MB-231细胞进行裂解和总RNA提取。取2 μg总RNA和2 μL反转录引物,根据M-MLV试剂盒说明进行反转录合成cDNA,采用qPCR法扩增目的基因和内参基因。Rab7a基因敲除效率为Rab7a mRNA表达水平降低百分比,Rab7a mRNA表达水平以每组测得的目的基因Rab7a和内参基因GAPDH的CT值并采用2-ΔΔCt法进行计算。ΔCt=目的基因Ct值-内参基因Ct值,ΔΔCt=阴性对照组ΔCt平均值-各样品ΔCt值。Rab7a基因引物序列见表 2

表 2 Rab7a基因和内参基因引物序列 Tab. 2 Primer sequences of Rab7a gene and internal reference gene
GeneSequence (5′-3′)
Rab7a senceGTCGGGAAGACATCACTCA
Rab7a antisenceCTAGCCTGTCATCCACCAT
GAPDH senceTGACTTCAACAGCGACACCCA
GAPDH antisenceCACCCTGTTGCTGTAGCCAAA
1.6 芯片实验

采用TRIzol法抽提阴性对照组和KD2组样品总RNA,抽提所得总RNA经NanoDrop 2000和Agilent Bioanalyzer 2100质检,合格样本进入芯片实验。芯片实验的步骤主要包括样品的制备、芯片杂交、芯片洗染、芯片扫描和结果分析。

1.7 Rab7a基因敲除后一体化通路分析(IPA)

IPA是一个一体化在线整合分析软件(www.ingenuity.com)[8],用于基因、microRNA数据和小规模实验数据的分析。IPA建立了可视化的实验系统,用于理解基因、蛋白质、化学物质和药物等属性,同时可呈现分子之间相互作用的关系网。IPA使用网络生成算法,按照本课题组预设的网络大小将分子之间的网络图分割成多个网络,并给每一个网络进行打分。Score基于P值计算,反映了网络中的数据集分子出现在该网络中为随机过程的概率。Score打分是基于超几何分布,通过右尾的Fisher精确检验获得显著性水平的负对数值。所有的网络使用Score值进行排序。Score值大于2代表该功能被显著激活,Score值小于-2代表该功能被显著抑制。

1.8 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。Rab7a基因敲除效率以x±s表示,多组间样本均数比较采用完全随机设计的单因素方差分析,组间两两比较采用SNK-q检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组乳腺癌细胞中Rab7a蛋白表达

以表达Rab7a的293T细胞作为阳性对照,收集对数生长期乳腺癌ZR-75-30、MCF-7、T-47D、MDA-MB-231和HCC-1937细胞总蛋白,Western blotting法分析结果显示:与阳性对照组比较,乳腺癌ZR-75-30、T-47D、MDA-MB-231和HCC-1937细胞中均可见Rab7a蛋白表达。见图 1

Lane 1: Positive control group(293T cells); Lane 2: ZR-75-30 cells; Lane 3: MCF-7 cells; Lane 4: T-47D cells; Lane 5: MDA-MB-231 cells; Lane 6: HCC-1937 cells. 图 1 各组乳腺癌细胞中Rab7a蛋白表达电泳图 Fig. 1 Electrophoregram of expressions of Rab7a protein in breast cancer cells in various groups
2.2 慢病毒感染MDA-MB-231细胞中荧光表达

MDA-MB-231细胞感染慢病毒96 h后,阴性对照组和KD1、KD2、KD3及KD4组细胞生长状态良好,病毒感染率达到90%以上。见图 2(插页三)。

A, F: Negative control group; B, G: KD1 group; C, H: KD2 group; D, I:KD3 group; E, J: KD4 group; A-E: Bright field; F-J: Green fluorescence field. 图 2 各组慢病毒感染MDA-MB-231细胞中荧光表达(×100) Fig. 2 Fluorescence expression in MDA-MB-231 cells in various groups infected by lentivirus(×100)
2.3 各组MDA-MB-231细胞中Rab7a基因敲除效率

与阴性对照组比较,KD1组MDA-MB-231细胞中Rab7a mRNA表达水平下调了76.2%,即Rab7a基因敲除效率为76.2%;KD2组MDA-MB-231细胞中Rab7a mRNA表达水平下调了87.9%,KD3组MDA-MB-231细胞中Rab7a mRNA表达水平下调了86.2%,KD4组MDA-MB-231细胞中Rab7a mRNA表达水平下调了58.2%;与其他各组比较,KD2组细胞的靶序列具有最高的敲除效率(P < 0.001),即KD2组细胞的靶序列是敲除效率最高的靶点。见图 3

*P < 0.01 vs negative control group. 图 3 各组MDA-MB-231细胞中Rab7a mRNA表达水平 Fig. 3 Expression levels of Rab7a mRNA in MDA-MB-231 cells in various groups
2.4 Rab7a基因敲除后的显著性差异基因分布

对Rab7a敲除效率最高的KD2组与阴性对照组进行基因芯片检测结果显示:与阴性对照组比较,KD2组检测的上调基因数(262个)增多(P < 0.01),下调基因数(372个)增多(P < 0.01)。火山图展示了与阴性对照组和KD2组差异基因分布情况。横坐标代表经过以2为底对数转换的差异倍数,纵坐标代表经过以10为底对数转换的矫正显著性水平;红色表示差异倍数大于1.5、显著性水平小于0.05的所有探针。横坐标0左侧代表下调的基因数,右侧代表上调的基因数。见图 4(插页三)。

Red: KD2 group; Grey: Negative control group. 图 4 阴性对照组和KD2组差异基因分布 Fig. 4 Distribution of differential genes in negative control group and KD2 group
2.5 差异基因相关疾病与功能关系

对这634个差异基因进行疾病与功能的IPA,疾病与功能柱状图展示差异基因在疾病与功能分类中的富集情况。所有疾病与功能使用-Log(P value)值由高到底排序(即按照P值由小到大排序)。与阴性对照组比较,KD2组中与Rab7a相关联的基因主要与癌症、机体损伤和异常及细胞存活等有密切关联。见图 5

1:Cancer; 2:Organismal injuries and abomalities; 3:Cell death and survival; 4:Cell growth; 5:Protein synthesis; 6:Cell-to-cell signaling and interaction; 7:Cellular movement; 8:Cellular development; 9:Tumor morphology; 10:Organismal survival; 11:Gastrointestinal disease; 12:Hematological system development and function; 13:Immune cell trafficking; 14:Hematological disease; 15:Immunological disease. 图 5 差异基因相关疾病与功能关系的直条图 Fig. 5 Histogram of disease and function associated with different genes
2.6 指定基因IPA网络图

根据指定基因VEGFA、IRS1、RPS6KB1、EIF4E和PRKAA1,添加目的基因Rab7a,通过IPA分析平台绘制基因关系网络图。在网络图中,Rab7a基因敲除导致eIF4F和IRS1表达下调以及激酶RPS6KB1表达下调;激酶PRKAA1和IKBKE表达上调及VEGFA和转录因子ATF2表达上调。见图 6

图 6 指定基因的IPA网络图 Fig. 6 IPA network diagram of specific genes
3 讨论

乳腺癌已成为全球女性发病率最高的恶性肿瘤[9],且死亡率持续升高[10], 其中TNBC占浸润性乳腺癌的10%~20%,严重影响女性健康与生活质量[11]。由于TNBC不表达雌激素受体(estrogenreceptor,ER)、孕激素受体(progesteronereceptor,PR)和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2),因此内分泌治疗及抗HER2分子靶向治疗对TNBC患者无效[12]。目前有效的全身治疗方法是具有细胞毒性的化疗,这种治疗方式不良反应大且耐药性高[13]。因此,探索TNBC发生变化的分子机制可能有助于深入了解这种疾病的治疗策略[14]

本课题组前期的研究[4]已经证实:Rab7a在乳腺癌中发挥致癌基因的作用, 促进乳腺癌的生长和侵袭。本研究中采用重组的4种不同靶序列的慢病毒敲除MDA-MB-231细胞的Rab7a基因,并成功获得持久基因沉默、稳定低表达Rab7a的MDA-MB-231细胞。通过对不同靶点敲除效率的验证,筛选出Rab7a敲除效率最高的KD2组进行基因芯片分析,结果显示:与Rab7a敲除相关联的基因有262个上调基因,372个下调基因。对差异基因进行IPA分析可见Rab7a及其相关联基因与癌症、细胞存活、机体损伤和异常、炎症、免疫反应等有密切联系,提示Rab7a及相关基因参与多种病理过程[15-18]。在指定的基因列表中,本研究通过添加目的基因Rab7a进行IPA分析,在基因网络分析图中,Rab7a与指定各基因相互作用并发生变化。真核起始因子(eIFs)在肿瘤发生发展起重要作用,mTOR/eIF4F轴有助于乳腺癌的维持和进展[19]。本研究中,eIF4F被Rab7a敲除后表达下调,提示Rab7a可能通过调节eIF4F而促进乳腺癌发生。此外,Rab7a沉默还导致RPS6KB1表达降低,有研究[20]显示:RPS6KB1在乳腺癌组织中发生了改变。本研究结果显示:Rab7a耗竭增强了PRKAA1的表达。目前PRKAA1在癌症发展中的作用尚不明确,PRKAA1和RPS6KB1在乳腺癌发展中的作用需要进一步研究。

综上所述,可将TNBC细胞中Rab7a作为一个靶基因,对其相关联基因进行IPA分析,全面预测Rab7a可能参与的疾病进程,并将Rab7a与其相关基因进行相互关联分析,为将来更深层次的研究奠定基础。

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