吉林大学学报(医学版)  2020, Vol. 46 Issue (03): 458-463     DOI: 10.13481/j.1671-587x.20200305

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付鑫, 龚福梅, 丁宁, 朱静, 杨春光, 胡学军
FU Xin, GONG Fumei, DING Ning, ZHU Jing, YANG Chunguang, HU Xuejun
类弹性蛋白展示NT-proBNP双抗原表位重组蛋白的制备和纯化
Preparation and purification of recombinant proteins of elastin-like polypeptide for displaying two epitopes of NT-proBNP
吉林大学学报(医学版), 2020, 46(03): 458-463
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2020, 46(03): 458-463
10.13481/j.1671-587x.20200305

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收稿日期: 2019-07-19
类弹性蛋白展示NT-proBNP双抗原表位重组蛋白的制备和纯化
付鑫 , 龚福梅 , 丁宁 , 朱静 , 杨春光 , 胡学军     
大连大学医学研究中心, 辽宁 大连 116622
[摘要]: 目的 利用大肠杆菌(E.coli)高效制备类弹性蛋白(ELP)展示N端脑钠肽前体(NT-proBNP)双抗原表位的重组蛋白,为低成本、高效地制备NT-proBNP检测校准品提供依据。方法 分别设计NT-proBNP第13~20位和第63~71位氨基酸残基表位,通过柔链连接上述2个抗原表位与ELP融合,获得3种融合蛋白。利用基因工程技术合成编码以上3种融合蛋白的基因并克隆到pET-28a(+)载体上,转入E.coli BL21(DE3)自动诱导表达,利用多次可逆相变循环(ITC)纯化重组蛋白,并应用Western blotting和ELISA法检测其抗体特异结合表位的能力。结果 成功构建了3种ELP展示NT-proBNP抗原表位的载体,并在E.coli中表达获得相应重组蛋白。Western blotting和直接ELISA检测,ELP展示的特异抗原表位均具有良好的与相应抗体结合的能力。夹心ELISA法检测,ELP展示NT-proBNP双抗原表位重组蛋白的蛋白浓度与450 nm处吸光度(A)值呈双对数线性剂量依赖关系(r=0.9197,P < 0.01)。结论 成功利用ELP展示NF-proBNP双抗原表位,为低成本、高效地制备出与NT-proBNP检测校准品奠定了基础。
关键词: N-端脑钠肽前体    类弹性蛋白    抗原表位    大肠杆菌    心力衰竭    
Preparation and purification of recombinant proteins of elastin-like polypeptide for displaying two epitopes of NT-proBNP
FU Xin , GONG Fumei , DING Ning , ZHU Jing , YANG Chunguang , HU Xuejun     
Medical Research Center, Dalian University, Dalian 116622, China
[ABSTRACT]: Objective To use Escherichia coli (E. coli)to prepare the recombinant proteins of elastin-like polypeptide(ELP) for displaying the two epitopes of N-terminal pro-brain natriuretic peptide(NT-proBNP), and to provide the basis for the low-cost and high-efficiency preparation of NT-proBNP detection calibrator. Methods The epitopes of 13-20 and 63-71 amino acid residues of NT-proBNP were designed and fused with ELP by flexible chain; three kinds of fusion proteins were obtained. The genes encoding the three fusion proteins mentioned above were synthesized by genetic engineering technique and cloned into the pET-28a (+) vector; the recombinant proteins were induced and expressed automatically in E.coli BL21(DE3), the recombinant proteins were purified with inverse transition cycling(ITC), and the abilities of their antibodies specificly binding epitopes were detected by Western blotting and ELISA methods. Results Three kinds of vectors of ELP for displaying NT-proBNP epitopes were successfully constructed, and the corresponding recombinant proteins were expressed in the E.coli. The western blotting and direct ELISA results showed that the specific epitopes displayed by ELP had the better binding ability with the relative antibodies.The results of Sandwich ELISA showed that the protein concentrations of recombinant proteins of ELP for displaying two epitopes of NT-proBNP had a double logarithmic linear dose-dependent relationship with the absorbance (A) value at 450 nm (r=0.9197, P < 0.01). Conclusion The ELP is successfully used to display the two epitopes of NT-proBNP, and lay a foundation for the low-cost and high-efficiency preparation of the NT-proBNP detection calibrator.
KEYWORDS: amino-terminal pro-brain natriuretic peptide    elastic-like polypeptide    epitope    Escherichia coli    heart failure    

人体血浆中N端脑钠肽前体(N-terminal pro-brain natriuretic peptide, NT-proBNP)是检测无症状心衰和早期心衰的高灵敏性重要指标,对早期发现和治疗心衰患者、有效降低心衰患者的发病率及病死率具有重大意义[1-2]。另外,NT-proBNP还可作为诊断无症状晚期慢性肾脏疾病[3]和慢性阻塞性肺病[4]的独立检测指标,具有广泛的临床应用和研究价值[5]。目前市场上已经有多家商品化的NT-proBNP免疫检测试剂[6-7],其校准品来源广泛,包括人工合成、大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli)、酵母和哺乳动物细胞表达的重组蛋白。上述几种来源的重组蛋白各有优势,但纯化重组蛋白大多数采用层析方法,且部分重组蛋白还不能直接用于检测,需增加去除融合标签这一步骤,生产方法繁琐且成本较高,成本可达0.1 mg/1000美元,因此成为制约其发展的主要因素。

类弹性蛋白(elastic-like polypeptide, ELP)是近十几年开发的一种融合标签,可通过可逆相变循环(inverse transition cycling, ITC)方法更简单、更经济地纯化蛋白[8]。ELP主要由五肽重复序列单元(VPGXG)n串联组成,其中客座残基X可以是除脯氨酸以外的任一种氨基酸,n代表ELP链中五肽重复次数[9-10]。外源蛋白和ELP融合后可同样保留ELP可逆相变的性质,利用温度诱导的多次ITC达到分离纯化蛋白的目的[11-12]。该方法操作简单、成本低且回收率高,适用于工业规模生产,纯化蛋白效率明显优于色谱等传统蛋白纯化方法,与层析法效果相近[13]

本研究采用本实验室自行设计的客座残基为异亮氨酸的低相变温度(transition temperature, Tt)ELP蛋白[14]首次进行展示NT-proBNP双表位研究,在E.coli中高效表达ELP展示NT-proBNP的第13~20位和第63~71位氨基酸残基表位的重组蛋白,并通过温度诱导ITC方法,快速分离纯化具有NT-proBNP双表位抗原性的ELP重组蛋白,为低成本、高效快速地制备出NT-proBNP检测校准品奠定基础。

1 材料与方法 1.1 菌株和主要试剂

E. coli BL21(DE3)和E. coli JM109购自美国Novagen公司。基因合成全部由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。HRP标记小鼠来源抗人NT-proBNP的第13~20位氨基酸表位的单克隆抗体(13G1213-20)、小鼠来源抗人NT-proBNP的第63~71位氨基酸表位的单克隆抗体(15C463-71)购自美国HyTest公司,硫酸卡那霉素(终浓度为50 mg·L-1)、DNase(终浓度50 mg·L-1)及HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体购自南京生工生物工程有限公司, ECL发光试剂盒购自美国Tanon公司, TMB显色液购自美国Sigma公司。

1.2 ELP展示NT-proBNP抗原表位基因设计、合成和克隆

为了获得具有抗原抗体结合能力的NT-proBNP双抗原表位融合蛋白,首先进行ELP展示单抗原表位研究,评估特异抗体与展示表位的结合能力,在此基础上进一步进行展示双表位研究。为此,分别设计了2个ELP展示NT-proBNP单个表位及1个展示双表位的融合基因。选取编码30~40个VPGIG串联碱基序列,通过编码柔链的氨基酸残基序列与编码NT-proBNP特异表位氨基酸残基序列相连,形成融合基因;为减小2个表位的相互影响,2个表位之间也通过编码柔链序列相连,基因结构和表达框见图 1。所选取NT-proBNP表位分别为编码NT-proBNP的第13~20位氨基酸残基ETSGLQEQ碱基序列和编码第63~71位氨基酸残基GHRKMVLYT碱基序列。ELP与NT-proBNP表位之间的柔链氨基酸残基序列为NNNNNNNNNN,2个表位之间的柔链氨基酸残基序列为NNNNNGGGGS(其中N代表天冬氨酸残基、G代表甘氨酸残基、S代表丝氨酸残基)。根据E.coli密码子偏好性,委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成上述3个基因,并将融合基因克隆至pET-28a(+)的NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点上构建表达载体。3个基因分别命名为ELP-E13-20、ELP-E63-71和ELP-E(13-20)-(63-71)

A: Diagram of ELP-E13-20 fusion gene; B: Diagram of ELP-E63-71 fusion gene; C: Diagram of ELP-E(13-20)-(63-71) fusion gene. 图 1 ELP展示NT-proBNP抗原表位基因结构图 Fig. 1 Diagrams of gene structures of ELP for displaying NT-proBNP epitopes
1.3 ELP展示NT-proBNP抗原表位重组蛋白表达

分别将携带ELP-E13-20、ELP-E63-71和ELP-E(13-20)-(63-71)基因的表达载体转入E.coli BL21(DE3)中,37 ℃过夜培养。挑取单克隆菌株接种到含有卡那霉素(终浓度50 mg·L-1)的LB培养基中振荡培养。次日以1:100接种到自动诱导培养基中大量培养,经28℃诱导表达24 h后留取600nm处吸光度(A)值为1的菌量,以诱导前菌液为阴性对照进行Western blotting鉴定。自动诱导培养基配方:5%的20×NPS 20 mL,2%的50×5052 8 mL和0.1%的1mol·L-1 MgSO2 0.4 mL加入ZY配置成400 mL体系培养基。其中ZY由10 g·L-1胰蛋白胨和5 g·L-1酵母提取物加入ddH2O配制而成,pH=7.2;20×NPS由0.1 mol·L-1 PO42-、0.025 mol·L-1 SO42-、0.05 mol·L-1NH4+、0.1 mol·L-1 Na+和0.05 mol·L-1 K+加入ddH2O配制而成,pH=7.4;50×5052由0.5%甘油、0.05%葡萄糖和0.2% α-乳糖加入ddH2O配制而成。

1.4 ELP展示NT-proBNP抗原表位重组蛋白的纯化

将大量培养后的菌液低温离心收集菌体,沉淀用约25 mL无盐PBS(0.02 mol·L-1)重悬,保存于-80℃冰箱。菌液经反复冻融2次后置于冰浴中超声破碎(条件:80 W,破碎时间2 s,破碎间隔3 s,总时间20 min),10 000 r·min-1、4 ℃离心10 min,弃除沉淀,将上清移入新管中并加入DNase(终浓度50 mg·L-1),冰浴20 min,10 000 r·min-1离心10 min,弃除沉淀,上清移入新管。处理后的上清进行ITC蛋白纯化,向上清液中添加NaCl固体至终浓度为2 mol·L-1,37℃水浴20 min溶解,10 000 r·min-1于30 ℃离心10 min后弃上清;沉淀加入20 mL预冷无盐PBS重悬,冰浴20 min,10 000 r·min-1于4 ℃离心10 min后弃沉淀,再将上清移入新管。此即为一轮ITC。经过4轮ITC纯化处理后,得到纯化的NT-proBNP特异抗原表位重组蛋白。

1.5 ELP展示NT-proBNP抗原表位重组蛋白的纯度鉴定和Tt测定

取80 μL纯化后蛋白样品加入20 μL 5×Loading Buffer混匀,99 ℃裂解制样并进行SDS-PAGE冰上电泳,通过凝胶显示单一蛋白条带鉴定重组蛋白纯度。采用BCA定量法测定蛋白浓度,并采用PBS(0.02 mol·L-1)将蛋白稀释至终浓度为10 μmol·L-1,取100 μL加入酶标版中,以1 ℃为梯度测定从23 ℃到40 ℃重组蛋白溶液于波长为350nm处A值,每个温度设置3个平行结果,当A(350)值为最大A值1/2时,该温度即为ELP重组蛋白的Tt。

1.6 ELP展示NT-proBNP抗原表位重组蛋白特异性分析

采用ELISA法测试重组蛋白在pH值为7.4时与相应抗体的结合特异性,以0.02 mol·L-1无盐PBS作为空白对照孔。将纯化蛋白在PBS缓冲液中以10 μmol·L-1浓度梯度稀释,每孔设置3个平行孔,4 ℃包被于96孔板上过夜孵育。其中ELP展示单抗原表位ELP-E13-20和ELP-E63-71重组蛋白采用直接ELISA方法检测,分别对应抗NT-proBNP的13~20及63~71表位的鼠源单克隆抗体13G1213-20和15C463-71。TMB显色,终止反应后测定各孔A(450)值,以蛋白浓度为横坐标,各浓度点测定A(350)值为纵坐标,应用GraphPad Prism绘制四参数逻辑拟合曲线。

ELP展示双抗原表位ELP-E(13-20)-(63-71)重组蛋白采用2种方法检测,方法一同上述方法,分别与13G1213-20和15C463-71单克隆抗体孵育行直接ELISA检测并做拟合曲线;方法二采用双抗体夹心ELISA方法,以单克隆抗体15C463-71 (抗体1:1 000稀释,终浓度为7.0 mg·L-1)捕获抗原蛋白,单克隆抗体13G1213-20 (1:1 000稀释,终浓度为0.7 mg·L-1)为检测抗体,TMB显色,终止反应后测定各孔A(450)值,以蛋白浓度为横坐标,各浓度点测定A(450)值为纵坐标,应用GraphPad Prism绘制15C463-71和13G1213-20检测系统的log-log双对数校准曲线。

2 结果 2.1 ELP展示NT-proBNP抗原表位重组蛋白表达

将重组质粒转入E.coli BL21(DE3)宿主后,自动诱导表达24 h,以诱导前收集菌液为阴性对照,分别采用13G1213-20和15C463-712个单克隆抗体对蛋白表达情况进行Western blotting法检测的结果表明:重组蛋白ELP-E13-20、ELP-E63-71和ELP-E(13-20)-(63-71)在自动诱导条件下均获得高效表达(图 2),同时证明ELP所展示的表位均能与相应抗体特异结合。3种重组蛋白的相对分子质量与理论相对分子质量相符,分别为157 00、160 00和252 00。

A: 13G1213-20 antibody; B: 15C463-71 antibody.M: Protein marker; Lane 1: ELP-E13-20 without induction; Lane 2: ELP-E13-20 with induction; Lane 3: ELP-E63-71 without induction; Lane 4: ELP-E63-71 with induction; Lane 5: ELP-E(13-20)-(63-71) without induction; Lane 6: ELP-E(13-20)-(63-71) with induction. 图 2 Western blotting法检测NT-proBNP重组蛋白表达电泳图 Fig. 2 Electrophoregram of expressions of recombinant proteins of NT-proBNP detected by Western blotting method
2.2 ELP展示NT-proBNP抗原表位重组蛋白纯化

采用ITC方法将自动诱导24 h后的ELP-E13-20、ELP-E63-71和ELP-E(13-20)-(63-71)重组蛋白从菌体中分离出来。通过4次ITC纯化,SDS-PAGE电泳检测显示上述3种重组蛋白均获得纯化(图 3),经BCA法检测,每升自动诱导表达培养基中可纯化2.0~2.5 mg重组蛋白。纯化条带相对于理论值的位置较低,可能是盐离子浓度对蛋白的影响导致,这也是ELP在SDS-PAGE蛋白电泳检测时的常见现象[8, 15]。测定蛋白浓度为10 μmol·L-1时ELP-E13-20、ELP-E63-71和ELP-E(13-20)-(63-71)重组蛋白Tt分别为(29.7±0.5)℃、(28.5±0.25)℃和(30.8±0.2)℃。

M: Protein marker; Lane 1: ELP-E13-20; Lane 2: ELP-E63-71; Lane 3: ELP-E(13-20)-(63-71). 图 3 SDS-PAGE法检测纯化的NT-proBNP重组蛋白电泳图 Fig. 3 Electrophoregram of purified recombinant proteins of NT-proBNP detected by SDS-PAGE method
2.3 ELP展示NT-proBNP抗原表位重组蛋白的结合能力

采用直接ELISA方法分别检测13G1213-20和15C463-71抗体与ELP展示抗原表位重组蛋白的结合能力见图 4。3种蛋白的参数逻辑拟合曲线显示:重组蛋白浓度与A值呈现良好的S形曲线,相关系数(R2)均在0.99以上,拟合优度高。13G1213-20和15C463-71单克隆抗体可以分别与ELP展示NT-proBNP双抗原表位重组蛋白上的表位结合,说明双抗原表位间柔链设计合理。采用夹心ELISA方法分别将15C463-71和13G1213-20单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体,定量检测ELP-E(13-20)-(63-71)重组蛋白样品标准曲线,见图 5。双对数线性回归分析显示:ELP-E(13-20)-(63-71)与A(450)值呈双对数线性剂量依赖关系,其中相关系数(r)= 0.9197 (P < 0.01),其绝对值为0.8~1.0,说明两者之间存在极强的相关关系,可信度高;R2=0.999 8,说明回归直线对观测值的拟合程度非常好。

A: Immunoassay for ELP-E13-20 using 13G1213-20 antibody; B: Immunoassay for ELP-E63-71 using15C463-71 antibody; C: Immunoassay for ELP-E(13-20)-(63-71) using 13G2213-20 antibody; D: Immunoassay for ELP-E(13-20)-(63-71) using 15C463-71 antibody. 图 4 直接ELISA法检测13G1213-20和15C463-71抗体与ELP展示抗原表位重组蛋白的结合能力 Fig. 4 Binding abilities of 13G1213-20 and 15C463-71 antibodies and recombinant proteins of ELP for displaying epitopes detected by direct ELISA method
15C463-71 was a capture antibody and 13G213-20 was a detection antibody; r=0.919 7, P < 0.01. 图 5 夹心ELISA法测定ELP-E(13-20)-(63-71)重组蛋白标准曲线 Fig. 5 Standard curve of recombinant protein of ELP-E(13-20)-(63-71) detected by Sandwich ELISA method
3 讨论

本研究采用ELP展示NT-proBNP线性表位,探索了低成本、高效地制备NT-proBNP检测校准品的方法。NT-proBNP相对分子质量为8 600,属于低相对分子质量多肽,目前生产NT-proBNP的普遍策略是利用基因工程与其他蛋白融合并在E.coli中表达[16-19]。与脑钠肽融合的常用蛋白:硫氧还蛋白(Trx)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST) [18]、Ssp dnaB微型蛋白内含子[19]和人血清白蛋白(human serum albumin, HSA) [20]等。KIM等[21]采用来自肝片吸虫的Fh8多肽作为融合标签高效生产NT-proBNP,可纯化出大量NT-proBNP重组蛋白,但是需使用蛋白酶将NT-proBNP从融合蛋白上切割下来才能进一步用作检测校准品。上述方法中大多数需利用层析法纯化蛋白,而且重组蛋白不能直接用于检测,增加了获取大量目的蛋白的生产步骤和生产成本。

本研究采用的ELP融合标签是一种通过可逆相变直接纯化的重组蛋白,其与靶蛋白融合后可以在E.coli中高效、可溶地表达,该技术是更简单、更经济的纯化蛋白方法。目前临床对NT-ProBNP的检测通常运用免疫学夹心法[22]来测定样本浓度,本课题组选择2个抗原表位与ELP融合用于夹心ELISA法检测。研究[23]表明:心衰患者血浆中NT-proBNP是O-糖基化蛋白,其中心区域第28~56位氨基酸残基部位被糖基化,所以该区域表位的抗体很难被识别。为了确保人血浆中NT-proBNP检测的准确性,HyTest公司推荐其筛选出的15C463-71-13G1213-20抗体组合作为捕获抗体-检测抗体[24],其可分别与NT-proBNP多肽的第63~ 71位和第13~20位氨基酸残基表位高效结合,所以本课题组最终选用以上2段多肽作为展示双表位,不受糖基化影响,适用于NT-proBNP精确检测系统。

本课题组首先对ELP展示NT-proBNP单表位的研究显示:在无需去除ELP融合标签的情况下,展示NT-proBNP部分线性表位的重组蛋白仍具有抗原性,且无论在变性条件下还是非变性条件下均能与相应特异抗体结合,进而设计ELP通过10个天冬氨酸残基(N)的柔链展示NT-proBNP双特异抗原表位,并采用NNNNNGGGGS柔链序列将双表位隔开,以减小表位之间空间位阻,充分将2个表位展示出来。夹心ELISA法测定ELP-E(13-20)-(63-71)双对数曲线显示:本课题组设计的NT-proBNP重组蛋白无需将ELP融合标签切割下来就能够同时与相应的捕获抗体和检测抗体结合,该设计也不需要融合表达全部NT-proBNP多肽序列,只选取2个表位进行表征即可作为检测校准品。

综上所述,选取ELP标签作为融合蛋白展示NT-proBNP特异抗原表位提供了一种低成本、纯化携带多个特异抗原表位的方法,为生产其他多肽抗原检测校准品提供了思路。

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