吉林大学学报(医学版)  2020, Vol. 46 Issue (02): 260-265     DOI: 10.13481/j.1671-587x.20200209

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钟哲峰, 谢靖婧, 何剑, 江波, 吕剑
ZHONG Zhefeng, XIE Jingjing, HE Jian, JIANG Bo, LYU Jian
L-苏糖酸镁增强恩替卡韦对HBV感染小鼠的抗病毒作用及其机制
Enhancement effect of magnesium-L-threonate for antiviral effect of entecavir in HBV-infected mice and its mechanism
吉林大学学报(医学版), 2020, 46(02): 260-265
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2020, 46(02): 260-265
10.13481/j.1671-587x.20200209

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收稿日期: 2019-05-27
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钟哲峰, 谢靖婧, 何剑, 江波, 吕剑. L-苏糖酸镁增强恩替卡韦对HBV感染小鼠的抗病毒作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2020, 46(02): 260-265.
ZHONG Zhefeng, XIE Jingjing, HE Jian, JIANG Bo, LYU Jian. Enhancement effect of magnesium-L-threonate for antiviral effect of entecavir in HBV-infected mice and its mechanism[J]. Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2020, 46(02): 260-265.
L-苏糖酸镁增强恩替卡韦对HBV感染小鼠的抗病毒作用及其机制
钟哲峰1 , 谢靖婧1 , 何剑1 , 江波1 , 吕剑2     
1. 南华大学附属南华医院感染科, 湖南 衡阳 421002;
2. 南华大学附属南华医院儿科, 湖南 衡阳 421002
收稿日期: 2019-05-27
基金项目: 湖南省教育厅科研基金资助课题(17B231);湖南省衡阳市科技局科学技术发展项目资助课题(2016KS12)
作者简介: 钟哲峰(1977-), 男, 湖南省湘乡市人, 副主任医师, 医学硕士, 主要从事感染科疾病诊治方面的研究。
通信作者: 吕剑, 副主任医师(Tel:0734-6387876, E-mail:nanhua415@126.com)
[摘要]: 目的 观察L-苏糖酸镁（MLT）是否可增强恩替卡韦（ETV）对乙型肝炎病毒（HBV）感染小鼠的抗病毒作用，并初步探讨其机制。方法 采用高压水动力法经尾静脉注射携带1.3拷贝HBV基因组（ayw亚型）的重组8型腺相关病毒建立HBV持续感染的C57BL/6小鼠模型。成模后分为模型组、MLT组（1.2 g·kg-1 L-苏糖酸镁胶囊）、ETV组（75 μg·kg-1恩替卡韦片）、联合处理组（1.2 g·kg-1 L-苏糖酸镁胶囊+75 μg·kg-1恩替卡韦片），每组8只；另选取8只未经病毒感染的正常小鼠作为对照组，连续给药4周。采用ELISA法检测小鼠血清HBsAg和HBeAg水平；采用荧光定量PCR法检测小鼠肝脏组织及血清中HBV DNA拷贝数；分离小鼠外周血CD8+T细胞，检测小鼠血清及CD8+T细胞中Mg2+含量，并采用流式细胞仪检测小鼠外周血CD8+T细胞中表面分子程序性死亡受体1（PD-1）、自然杀伤细胞活化受体（NKG2D）、CD95和CD38表达水平。结果 与对照组比较，模型组小鼠血清和CD8+T细胞中Mg2+含量及CD8+T细胞中表面活化性分子NKG2D和CD38表达水平明显降低（P < 0.05），而抑制性分子PD-1和CD95表达水平明显升高（P < 0.05）；与模型组比较，各给药组小鼠血清HBsAg、HBeAg水平及肝脏组织和血清中HBV DNA拷贝数均明显降低（P < 0.05），且联合处理组小鼠各指标改善效果最好；与模型组比较，MLT组和联合处理组小鼠血清及CD8+T细胞中Mg2+含量及CD8+T细胞表面活化性分子NKG2D和CD38表达水平明显升高（P < 0.05），而抑制性分子PD-1和CD95表达水平明显降低（P < 0.05），但ETV组小鼠各指标差异无统计学意义（P>0.05）。结论 MLT可增强ETV对HBV感染小鼠的抗病毒作用，其机制可能是MLT可引起CD8+T细胞内Mg2+含量增加，提高CD8+T细胞活性，进而更加有效地清除HBV。
关键词: 乙型肝炎病毒    L-苏糖酸镁    恩替卡韦    CD8+T细胞    
Enhancement effect of magnesium-L-threonate for antiviral effect of entecavir in HBV-infected mice and its mechanism
ZHONG Zhefeng1 , XIE Jingjing1 , HE Jian1 , JIANG Bo1 , LYU Jian2     
1. Department of Infectious Diseases, Affiliated Nanhua Hospital, University of South China, Hengyang 421002, China;
2. Department of Pediatrics, Affiliated Nanhua Hospital, University of South China, Hengyang 421002, China
[ABSTRACT]: Objective To observe whether magnesium-L-threonate (MLT) can enhance the antiviral effect of entecavir (ETV) in the HBV-infected mice, and to explore its mechanism. Methods The recombinant adeno-associated virus 8 carrying 1.3 copies of HBV genome was injected into the C57BL/6 mice by tail vein to establish the HBV persistent infection mouse models. After successful modeling, the mice were divided into model group, MLT group (1.2 g·kg-1 magnesium-L-threonate capsules), ETV group (75 μg·kg-1 entecavir tablets), and combined treatment group (1.2 g·kg-1 magnesium-L-threonate caspules+75 μg·kg-1 entecavir tablets) (n=8), and another 8 normal mice uninfected with HBV were selected as control group. Then all the mice were intragastrically administered for 4 weeks. The serum levels of HBsAg and HBeAg were detected by ELISA method, the copied of HBV DNA in liver tissue and serum of the mice were detected by quantitative real-time PCR. The peripheral blood CD8+ T cells were isolated, and the contents of Mg2+ in serum and CD8+ T cells were detected. The expression levels of PD-1, NKG2D, CD95 and CD38 in the CD8+ T cells were detected by flow cytometry. Results Compared with control group, the contents of Mg2+ in serum and CD8+ T cells and the expression levels of surface activation molecules NKG2D and CD38 in the CD8+ T cells in model group were significantly decreased (P < 0.05), while the expression levels of surface inhibitory molecules PD-1 and CD95 in the CD8+ T cells were significantly increased (P < 0.05). Compared with model group, the expression levels of serum HBsAg and HBeAg, and the copied of HBV DNA in liver tissue and serum of the mice in various administration groups were significantly decreased (P < 0.05), and the improvement degree of the indexes in combined treatment group was superior to other administration groups. Compared with model group, the contents of Mg2+ and the expression levels of NKG2D and CD38 in MLT group and combined treatment group were significantly increased (P < 0.05), the expression levels of PD-1 and CD95 were significantly decreased (P < 0.05), but there were no significant differences in ETV group (P>0.05). Conclusion MLT can enhance the antiviral effect of ETV in the HBV-infected mice, and the mechanism may be that MLT can cause the increase of Mg2+ contents in the CD8+ T cells to improve the activity of CD8+ T cells, and thereby HBV can be removed more effectively.
KEYWORDS: hepatitis B virus    magnesium-L-threonate    entecavir    CD8+ T cells    

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)引起的以肝损伤为主且与免疫异常相关的感染性疾病。研究[1]显示：全球有超过2.4亿人持续感染HBV，每年有超过70万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝癌等严重并发症。在我国，每年有近30万人死于与HBV相关的肝病，占全球因HBV感染相关死亡总人数的40%~50%[2]。目前，抗病毒治疗是CHB治疗的关键，而恩替卡韦(entecavir，ETV)是国际公认的HBV抗病毒治疗的一线抗病毒药物，具有抗HBV病毒活性强、耐药屏障较高和不良反应轻等特点[3]；但有部分CHB患者对ETV表现出应答不佳的现象。HBV感染是HBV与宿主免疫系统之间多方面相互作用的结果，先天性和适应性免疫在HBV清除中起着关键作用[4-5]。研究[6-7]已证实：在机体抗病毒免疫反应过程中，CD8+ T细胞是清除病毒的主要免疫细胞。但在HBV持续感染的免疫应答过程，CD8+ T细胞常常因功能衰竭而出现反应低下的现象[8]。有研究[9]显示：Mg2+可调节HBV感染过程中NK细胞和CD8+ T细胞免疫活性，促进病毒的清除。因此，通过激活机体自身免疫活性可为克服ETV应答不佳提供新的思路。本研究通过建立HBV持续感染小鼠模型，探讨L-苏糖酸镁(magnesium-L-threonate，MLT)联合ETV用药是否能够增强ETV对模型小鼠的抗病毒作用，并初步阐明其机制，为临床提高ETV应答率提供实验依据和理论基础。

1 材料与方法 1.1 实验动物、主要药品、试剂和仪器

无特定病原体(SPF)级雄性C57BL/6小鼠，7~8周龄，体质量20~23 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号：SYXK(湘)2014-0012。L-苏糖酸镁胶囊(规格：2000mg×120粒)，由美国Dr. Mercola公司生产；恩替卡韦片(规格：0.5mg×7片)，由中美上海施贵宝制药有限公司生产；携带1.3拷贝HBV基因组(ayw亚型)的重组8型腺相关病毒(rAAV8-1.3 HBV)，病毒滴度1.0×1012vg·mL-1，由北京五加和分子医学研究所有限公司制备和提供；小鼠乙型肝炎表面抗原(HBsAg)ELISA试剂盒和小鼠乙型肝炎e抗原(HBeAg)ELISA试剂盒均购自南京森贝伽生物科技有限公司；HBV核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)购自上海科华生物工程股份有限公司；EasySepTM小鼠CD8+ T细胞分选试剂盒购自加拿大Stemcell Technologies公司；PE-CF594 Hamster anti-Mouse CD279(PD-1)、APC Rat Anti-Mouse CD314(NKG2D)、PE-CF594 Hamster Anti-Mouse CD95和PE Rat Anti-Mouse CD38均购自美国BD公司；Mag-Indo 1荧光探针购自美国Sigma-Aldrich公司。荧光定量PCR仪(QuantStudio3)购自美国ThermoFisher公司，流式细胞仪(MoFlo XDP)和酶标仪(DTX880)购自美国Beckman公司。

1.2 HBV持续感染小鼠模型构建和实验动物分组

采用高压水动力法经C57BL/6小鼠尾静脉注射携带1.3拷贝HBV基因组(ayw亚型)的重组8型腺相关病毒(rAAV8-1.3 HBV)建立HBV持续感染小鼠模型[10-11]，注射剂量为每只小鼠注射200 μL病毒溶液(1.0×1011vg)。每只小鼠于注射后12周内每周进行一次眼眶采血，用于检测血清HBsAg水平，以每次检测血清HBsAg水平均＞1.0 PEIU·mL-1表示模型构建成功[12]。模型构建成功后，将小鼠随机分为模型组、MLT组、ETV组和联合处理组，每组8只，同时选取8只未经病毒感染的正常小鼠作为对照组。

1.3 药物处理和样品采集

造模成功后当天开始给药，对照组和模型组小鼠给予1.5 mL·kg-1生理盐水灌胃处理；MLT组小鼠给予1.2 g·kg-1 L-苏糖酸镁胶囊灌胃；ETV组小鼠给予75 μg·kg-1恩替卡韦片灌胃；联合处理组小鼠给予1.2 g·kg-1 L-苏糖酸镁胶囊+75 μg·kg-1恩替卡韦片灌胃。每天给药1次，连续4周。给药4周后，采用断头法处死小鼠取全血并完整分离小鼠肝脏备用。

1.4 小鼠外周血CD8+ T细胞分离

取小鼠全血，采用密度梯度离心法分离外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，再根据EasySepTM小鼠CD8+ T细胞分选试剂盒说明书实验步骤进行目的细胞标记，最后利用流式细胞仪分选CD8+ T细胞，备用。

1.5 小鼠血清HBV相关抗原检测

取小鼠全血分离血清，采用ELISA法检测HBsAg和HBeAg水平，具体操作按照试剂盒说明书进行，采用酶标仪测定450nm处吸光度(A)值，通过标准曲线计算血清中HBsAg和HBeAg水平。

1.6 小鼠血清和肝脏组织中HBV DNA拷贝数检测

取小鼠肝脏和血清，按照试剂盒说明书，采用荧光定量PCR法检测小鼠肝脏组织及血清中HBV DNA拷贝数。

1.7 CD8+ T细胞表面相关分子表达水平检测

各取1.0×106个CD8+ T细胞，重悬于HEPES缓冲液中，分别加入PE-PD-1、APC-NKG2D、PE/CF594-CD95和PE-CD38，混匀后室温避光孵育40 min，离心，弃上清，加入预冷PBS洗涤1次，离心、弃上清，500 mL PBS重悬细胞，流式细胞仪检测，计算阳性细胞百分率。阳性细胞百分率=阳性细胞数/总细胞数×100%，以阳性细胞百分率表示CD8+ T细胞表面相关分子表达水平。

1.8 血清和CD8+ T细胞中Mg2+含量检测

① 取小鼠全血，分离血清，采用全自动生化分析仪检测血清中Mg2+含量；②各取1.0×106个CD8+ T细胞，重悬于1 mL HEPES缓冲液(不含Mg2+和Ca2+)中，加入3 μmol·L-1荧光探针Mag-Indo 1溶液，37℃避光孵育20 min，加入预冷的HEPES缓冲液终止探针孵育，离心，弃上清，加入500 mL HEPES缓冲液重悬细胞，流式细胞仪检测，结果以相对平均荧光强度表示。

1.9 统计学分析

采用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析。各组大鼠血清HBsAg和HBeAg水平，血清和肝脏组织中HBV DNA拷贝数，外周血CD8+ T细胞表面相关分子表达水平以及血清和CD8+ T细胞中Mg2+含量均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组小鼠血清HBsAg和HBeAg水平

与模型组比较，MLT组、ETV组和联合处理组小鼠血清HBsAg和HBeAg水平均明显降低(P＜0.05)；与MLT组比较，ETV组小鼠血清HBsAg和HBeAg水平均明显降低(P＜0.05)；与ETV组比较，联合处理组小鼠血清HBsAg和HBeAg水平明显降低(P＜0.05)。见表 1。

表 1 各组小鼠血清HBsAg和HBeAg水平 Tab. 1 Levels of serum HBsAg and HBeAg of mice in various groups
[n=8, x±s, λB/(IU·L-1)]
Control 0.00±0.00 0.00±0.00
Model 337.12±45.27 2214.14±457.11
MLT 184.64±17.54* 867.25±157.98*
ETV 57.78±9.36*△ 141.25±47.69*△
Combined treatment 9.33±2.14*# 37.68±14.36*#
*P＜0.05 compared with model group；△ P＜0.05 compared with MLT group；# P＜0.05 compared with ETV group.
表选项
2.2 各组小鼠体内HBV DNA复制水平

与模型组比较，MLT组、ETV组和联合处理组小鼠血清及肝脏组织中HBV DNA拷贝数均明显降低(P＜0.05)，且ETV组明显低于MLT组，联合处理组上述指标又明显低于ETV组(P＜0.05)。见表 2。

表 2 各组小鼠血清和肝脏组织中HBV DNA拷贝数 Tab. 2 Copies of HBV DNA in serum and liver tissue of mice in various groups
(n=8, x±s)
Group Copy of HBV DNA
Serum
(×106 copies·L-1)		 Liver
(×105 copies·g-1)
Control 0.00±0.00 0.00±0.00
Model 11.45±2.34 190.24±53.64
MLT 3.64±0.95* 70.63±24.95*
ETV 1.05±0.18*△ 6.35±1.34*△
Combined treatment 0.09±0.01*# 0.57±0.14*#
*P＜0.05 compared with model group；△ P＜0.05 compared with MLT group；# P＜0.05 compared with ETV group.
表选项
2.3 各组小鼠外周血CD8+ T细胞中表面相关分子PD-1、CD95、NKG2D和CD38表达水平

与对照组比较，模型组小鼠外周血CD8+ T细胞中表面抑制受体PD-1和CD95表达水平明显升高(P＜0.05)，而激活受体NKG2D和CD38表达水平明显降低(P＜0.05)；与模型组比较，MLT组和联合处理组小鼠外周血CD8+ T细胞中表面抑制受体PD-1和CD95表达水平明显降低(P＜0.05)，而激活受体NKG2D和CD38表达水平明显升高(P＜0.05)，但ETV组各指标比较差异均无统计学意义(P＞0.05)；与ETV组比较，联合处理组小鼠外周血CD8+ T细胞中PD-1和CD95表达水平明显降低(P＜0.05)，且NKG2D和CD38表达水平明显升高(P＜0.05)。见表 3。

表 3 各组小鼠外周血CD8+ T细胞中表面相关分子PD-1、CD95、NKG2D和CD38表达水平 Tab. 3 Expression levels of PD-1, CD95, NKG2D and CD38 in CD8+ T cells in peripheral blood of mice in various groups
(n=8, x±s, η/%)
Group PD-1 CD95 NKG2D CD38
Control 3.02±0.87 6.35±1.06 27.36±3.07 36.21±4.67
Model 16.35±2.21* 23.14±3.72* 13.25±1.58* 18.36±2.57*
MLT 8.21±1.67△ 11.58±2.07△ 21.39±3.17△ 29.68±4.81△
ETV 14.57±3.01 20.71±4.68 16.32±3.96 19.35±3.09
Combined treatment 6.39±1.19△# 10.24±2.21△# 22.86±4.01△# 28.95±4.17△#
*P＜0.05 compared with control group；△ P＜0.05 compared with model group；# P＜0.05 compared with ETV group.
表选项
2.4 各组小鼠血清和CD8+ T细胞中Mg2+含量

与对照组比较，模型组小鼠血清和CD8+ T细胞中Mg2+含量明显降低(P＜0.05)；与模型组比较，MLT组和联合处理组小鼠血清和CD8+ T细胞中Mg2+含量明显增加(P＜0.05)，而ETV组差异无统计学意义(P＞0.05)；与ETV组比较，联合处理组小鼠血清和CD8+ T细胞中Mg2+含量明显增加(P＜0.05)。见表 4。

表 4 各组小鼠血清和CD8+ T细胞中Mg2+含量 Tab. 4 Contents of Mg2+ in serum and CD8+ T cells of mice in various groups
(n=8, x±s)
Group Content of Mg2+
Serum CD8+ T cells
Control 1.05±0.07 1.00±0.02
Model 0.34±0.04* 0.17±0.03*
MLT 3.37±0.85△ 1.97±0.27△
ETV 0.43±0.06 0.20±0.06
Combined treatment 3.14±0.78△# 1.81±0.39△#
*P＜0.05 compared with control group；△ P＜0.05 compared with model group；# P＜0.05 compared with ETV group.
表选项
3 讨论

目前，临床上主要是通过调整治疗方案来应对ETV应答不佳，黄飞等[13]对于ETV应答不佳的CHB患者采用ETV联合阿德福韦酯或使用替诺福韦替换ETV等挽救方案予以应对。有研究[14-15]显示：治疗前HBV DNA和HBsAg高水平、HBeAg阳性等因素是CHB患者对ETV应答不佳的相关因素。因此，在ETV应答早期通过提高机体免疫细胞杀伤效应，降低HBV DNA载量以及HBsAg和HBeAg水平，以增强后续ETV抗病毒效果，可能是克服ETV应答不佳的有效方法。本研究结果显示：MLT可以通过提高HBV感染小鼠外周血CD8+ T细胞免疫活性增强ETV的抗病毒作用，可为临床解决和避免ETV应答不佳的问题提供理论参考。

MLT是一种Mg2+含量高达78 mg·g-1的苏糖酸盐，可以作为Mg2+的供体对机体发挥保健或某些疾病的治疗作用。有研究[9, 16]显示：Mg2+可以通过介导T细胞受体(T cell receptor，TCR)途径激活T淋巴细胞的分化，进而调节免疫系统发挥抗病毒作用。而邵红玲等[17]研究发现：在慢性HBV感染患者外周血CD8+ T细胞中Mg2+含量明显低于正常水平。同时，CHAIGNE-DELALANDE等[9]研究表明：通过对X连锁镁离子通道缺陷联合免疫缺陷病(XMEN，镁离子通道蛋白Magt1缺陷并发EBV感染的疾病)患者补充Mg2+药剂，可增加细胞毒性T细胞(cell toxic lymphocytes, CTLs)和NK细胞胞内Mg2+含量，并恢复CTLs和NK细胞的细胞毒性，抑制EBV病毒复制，显示Mg2+对维持免疫细胞的免疫活性至关重要。本研究结果显示：MLT以及ETV或者二者联用均可明显降低HBV感染小鼠血清HBsAg和HBeAg水平以及血清和肝脏组织中HBV DNA拷贝数，但二者联用的效果更佳，说明单独补充MLT也可起到抗病毒的作用，但联合应用能表现出更强的抗病毒效果。本研究结果显示：MLT单独处理或联合ETV处理均可增加HBV感染小鼠血清内Mg2+含量，进而提高CD8+ T细胞内Mg2+浓度，而ETV单独处理则无显著变化；提示Mg2+在MLT增强ETV抗病毒作用过程中可能扮演重要角色。

在HBV慢性感染过程中，CD8+ T细胞功能耗竭是HBV持续感染的一个重要特征，也是导致CHB患者病情进一步恶化的主要原因[18]。在CD8+ T细胞功能耗竭过程中，其表面抑制性受体(PD-1、CD95和CTLA-4等)及活化性受体(NKG2D和CD38)发挥重要作用。临床研究[19]显示：HBV感染患者外周血CD8+ T细胞均出现不同程度的抑制性受体表达上调以及活化性受体表达下调的现象。基础研究[20-21]表明：抑制PD-1等受体表达可提高CD8+ T细胞免疫活性。本研究结果显示：模型组小鼠CD8+ T细胞表面抑制性分子PD-1和CD95表达上调，活化性分子NKG2D和CD38表达下调，与上述临床研究数据一致。而采用MLT或MLT联合ETV治疗后，CD8+ T细胞表面抑制性分子PD-1和CD95表达下调，而活化性分子NKG2D和CD38表达上调。说明补充Mg2+可促进CD8+ T细胞重新获得免疫功能。然而，MLT单独治疗对CD8+ T细胞表面分子表达较模型组无显著变化，主要是由于ETV药理机制是通过抑制HBV DNA聚合酶活性而阻断HBV-DNA的复制，对机体免疫活性无调节作用。

综上所述，MLT可增加CD8+ T细胞内Mg2+含量，上调细胞表面活化性分子NKG2D和CD38表达，下调抑制性分子PD-1和CD95表达，进而提高CD8+ T细胞免疫活性，增强HBV清除作用。若与ETV联用，其可通过调节机体免疫活性，降低机体HBV DNA拷贝数及HBsAg、HBeAg水平，为ETV发挥抗病毒作用降低应答基准，同时也可增强ETV的抗病毒作用。因此，MLT作为辅助药物是否能降低CHB患者ETV应答不佳发生率还需临床试验进一步研究证实。

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