衰老作为一种不可避免的生理过程，可导致身体部分功能逐渐丧失，其中认知能力下降已成为老年人最大的健康威胁之一^[1]。近年来有许多关于衰老相关机制的研究，如衰老的端粒学说、自由基学说和代谢失衡学说等^[2-4]。其中，自由基学说表明当人体内自由基生成过多或对其清除能力降低时，将发生各种严重病变^[5]，因此清除过量活性氧自由基具有重要的生理意义，安全有效的天然抗衰老药物成为人们关注焦点。

姬松茸(Agaricus blazei Murill, ABM)又名巴西蘑菇，是食药兼用的名贵真菌^[6]。姬松茸子实体主要成分包括蛋白质、多糖、脂肪、纤维和维生素等，其中多糖含量可达45%。多糖不仅是维持生命活动的功能性大分子，同时有广泛的药理学作用，如降血脂、降血糖、抗血栓、保肝和通过增加白细胞含量减少放射性破坏的生物活性^[7]。研究^[8]表明：姬松茸多糖(Agaricus blazei polysaccharide, ABP)具有抗肿瘤、调节免疫、改善脂质水平和保护损伤神经等作用。目前，关于ABP抗衰老功效少有报道。本课题组前期研究^[9]证实：ABP具有明显的抗氧化活性，体外清除自由基作用显著，由此本文作者推测ABP可能具有抗衰老的作用。

本研究分离纯化获得姬松茸酸性多糖A级分(Agaricus blazei polysaccharide-A，ABP-A)，利用D-半乳糖(D-galactose, D-Gal)诱导建立小鼠衰老模型，观察ABP-A的抗衰老作用，探讨其抗衰老作用的分子机制，旨在为研发天然的抗衰老药物提供新资源和研究基础，为进一步开发和利用ABM提供实验依据。

选取48只雄性ICR小鼠，体质量200~220 g，由长春亿斯实验动物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK(吉)2016-0003，本实验通过本校实验动物伦理委员会审查(伦理号IACUC-2018-004)，实验过程遵循3R原则给予人道关怀。ABM(沈阳聚鑫北虫草菌业有限公司，由北华大学药学院药用植物学教研室韩冬老师鉴定合格)，D-Gal(美国Genview公司)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)、过氧化氢酶(catalase，CAT)和活性氧(reactive oxygen species，ROS)测试盒(南京建成生物研究所)，一抗β-actin、Nrf2、Keap1、HO-1和二抗HRP-Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(美国ABclona公司)。Infinite M200型酶标仪(瑞士TECAN公司)，SW-CJ-2D型双人净化工作台(上海苏净实业有限公司)，TM-100 Morris水迷宫BA-200、小鼠避暗仪DT-200和小鼠跳台测试箱(成都泰盟技术有限责任公司)，BA 400显微镜(麦克奥迪实业集团公司)，离心机(德国Eppendorf公司)，超微量核酸蛋白测定仪(德国Scandrop公司)。

取干燥至恒重的ABM，按水料比20:1(V/W)，100℃提取3次，每次3 h，提取液浓缩离心，80%乙醇醇沉上清液，静置过夜，离心收集沉淀，依次用95%乙醇、无水乙醇洗涤，常规干燥得水提姬松茸粗多糖，透析，冷冻干燥，得ABP；利用DEAE-纤维素柱(7.5×30 cm，Cl-型)进行分级，0.5 mol·L^-1NaCl洗脱，除盐，冷冻干燥，得到ABP-A。

48只ICR小鼠随机分为4组，模型组小鼠颈背部皮下注射400 mg·kg^-1·d^-1D-Gal；对照组小鼠注射同剂量生理盐水；阳性药组小鼠先皮下注射400 mg·kg^-1·d^-1D-Gal，然后灌胃800 mg·kg^-1吡拉西坦(按照人每日口服剂量为40~80 mg·kg^-1)；ABP-A组小鼠先皮下注射400 mg·kg^-1·d^-1D-Gal，然后灌胃400 mg·kg^-1 ABP-A(按照人每日口服最大剂量计算)。连续给药10周。

给药第9周进行避暗实验，将小鼠面部背对洞口放入明室中，进行训练和重实验，记录5 min内小鼠进入暗室的次数和首次进入暗室的时间，即错误次数和潜伏期，间隔24 h后开始实验。

跳台实验：小鼠遭电击后逃到安全台上，再次下台遭受电击时视为错误反应，记录3 min内的潜伏期和错误次数^[10]，24 h后再次测验。

Morris水迷宫定位航行实验：设定实验时间为120 s，小鼠从入水到找到安全平台所需的时间即为逃避潜伏期。若120 s内找到平台，则使其在平台上停留10 s；若120 s内未找到平台，则将其引导至平台，并停留10 s，潜伏期记录为120 s。第7天开始空间搜索，撤掉平台，将小鼠从第Ⅱ象限入水，持续时间120 s。记录小鼠进入平台、目标区域及目标象限的次数。

小鼠行为学实验结束后，将小鼠眼球取血，离心，取血清备用。处死的小鼠，迅速于冰台上取出全脑。严格按照各试剂盒说明书进行操作，对小鼠血清进行检测。采用酶联反应法分析ROS水平，黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，比色法检测T-AOC活性，采用比色法检测CAT活性及硫代巴比妥酸法测定MDA水平。

提取小鼠脑组织海马区蛋白，以12% SDS-PAGE凝胶电泳分离，转膜2 h至甲醇处理后的聚丙二氟乙烯膜(PVDF)上，转膜，置于摇床，用含5%脱脂奶粉的TBS-T封闭液封闭1 h，然后加入一抗β-actin(1:50 000)、Nrf2(1:500)、Keap1(1:500)和HO-1(1:500)室温孵育2 h，采用TBS-T洗5次，每次15 min，加入二抗(1:2 000)室温孵育1 h，TBS-T洗5次，每次15 min，最后加入ECL显色液显色。将显影得到的条带进行灰度分析，以β-actin为内参，以Keap1、Nrf2和HO-1各条带与内参条带灰度值的比值表示蛋白表达水平。

采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。各组小鼠避暗和跳台实验潜伏期、错误次数，水迷宫实验空间探索指标，各组小鼠血清中SOD和CAT活性及T-AOC、ROS和MDA水平，脑组织中Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表达水平均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用SNK-q检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

透析袋透析除去灰分，得ABP，利用DEAE-纤维素柱进行离子交换层析，0.5 mol·L^－1 NaCl溶液洗脱得到ABP-A。ABP得率为4.7%、总糖含量为75.1%、糖醛酸含量为1.9%、蛋白含量为5.6%；ABP-A得率为47.5%、总糖含量为74.1%、糖醛酸含量为8.2%。见表 1。

避暗实验结果显示：与对照组比较，模型组小鼠避暗潜伏期明显缩短(P < 0.05或P < 0.01)，错误次数明显增多(P < 0.05)；与模型组比较，阳性药物组和ABP-A组小鼠避暗潜伏期延长(P < 0.05或P < 0.01)，错误次数减少(P < 0.05)。跳台实验结果显示：与对照组比较，模型组小鼠跳台潜伏期明显缩短(P < 0.05)，错误次数明显增多(P < 0.05)；与模型组比较，阳性药物组和ABP-A组小鼠跳台潜伏期延长(P < 0.05或P < 0.01)，错误次数减少(P < 0.05)。见表 2。

Morris水迷宫实验结果显示：定位航行实验中，随着训练时间的延长，各组小鼠定位航行潜伏期呈下降趋势(P < 0.05)。对照组小鼠定位航行潜伏期下降幅度最大，模型组下降幅度最小。第2~6天，与对照组比较，模型组小鼠定位航行潜伏期明显延长(P < 0.01)；与模型组比较，阳性药物组和ABP-A组小鼠定位航行潜伏期从第2天开始明显缩短(P < 0.05)。见图 1。空间搜索实验中，与模型组比较，阳性药物组和ABP-A组小鼠进入平台的时间(潜伏期)明显缩短(P < 0.05)。进入平台的次数明显增加(P < 0.05)。见图 2(插页五)和图 3。

图 1 Morris水迷宫实验中各组小鼠定位航行潜伏期 Fig. 1 Latencies of positioning and navigation of mice in various groups in Morris water maze test

图选项

A: Control group; B: Model group; C: Positive drug group; D: ABP-A group. 图 2 各组小鼠定位航行实验典型热图分析 Fig. 2 Typical heat map analysis of positioning and navigation experiment of mice in various groups

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*P < 0.05 compared with control group; △P < 0.05 compared with model group. 图 3 Morris水迷宫实验中各组小鼠空间探索指标 Fig. 3 Space exploration indicators of mice in various groups in Morris water maze test

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与对照组比较，模型组小鼠血清中SOD和CAT活性及T-AOC明显降低(P < 0.05)，ROS水平升高(P < 0.05)，MDA水平明显升高(P < 0.01)；与模型组比较，阳性药物组和ABP-A组小鼠血清中SOD活性和T-AOC升高(P < 0.05)，CAT活性明显升高(P < 0.05或P < 0.01)，ROS水平降低(P < 0.05)，MDA水平明显降低(P < 0.01)。见表 2。

与对照组比较，模型组小鼠脑组织中Nrf2和HO-1蛋白表达水平均明显降低(P＜0.05或P＜0.01)，Keap1蛋白表达水平升高(P＜0.05)；与模型组比较，阳性药物组和ABP-A组小鼠脑组织中Keap1蛋白表达水平明显降低(P＜0.05或P＜0.01)，Nrf2和HO-1蛋白表达水平明显升高(P＜0.05或P＜0.01)。见图 4和图 5。

Lane1: Control group; Lane2:Model group; Lane3:Positive drug group; Lane4:ABP-A group. 图 4 Western blotting法检测各组小鼠脑组织中Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表达电泳图 Fig. 4 Electrophoregram of expressions ofNrf2, Keap1 and HO-1 proteins in brain tissue of mice in various groups detected by Western blotting method

图选项

*P < 0.05, * *P < 0.01 compared with control group; △P < 0.05, △△P < 0.01 compared with model group. 图 5 各组小鼠脑组织中Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表达水平 Fig. 5 Expression levels of Nrf2, Keap1 and HO-1 proteins in brain tissue of mice in various groups

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衰老是生命发展的最后一个阶段，是随着时间的推移，机体的各种功能不断下降的过程, 衰老的发生与氧化应激的积累密切相关^[11]。D-Gal作为生理性营养成分，过量时会诱发机体氧化损伤、炎症以及细胞凋亡等, 与自然衰老症状相似^[12-13]。本研究中连续给予过量D-Gal后，模型组小鼠活动减少，毛发脱落，行为学实验表现出潜伏期较短，错误次数增多现象，说明小鼠衰老模型建立成功。SOD和CAT等组成的酶系统具有内源性抗氧化损伤作用，通过代谢转化可去除过量ROS减轻氧化应激^[14]。T-AOC通常被认为是体内所有抗氧化剂的累积作用，具有评估抗氧化能力的作用^[15]。MDA是氧自由基和脂质氧化的降解产物，其水平的升高导致自由基的产生增多和(或)抗氧化物质功能下降^[16]。本研究结果显示：给予ABP-A干预后，小鼠血清中SOD和CAT活性升高，T-AOC升高，MDA和ROS水平降低，小鼠一般状态得到有效改善，学习记忆能力提高，说明ABP-A能减缓由D-Gal诱导的机体氧化损伤程度，进而对衰老引起的学习记忆衰退具有良好的修复作用。

Keap1/Nrf2/ARE信号通路的激活可诱导产生一系列内源性酶，如SOD、CAT、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧还原酶等，这些自由基清除酶能够参与机体的抗氧化防御机制^[17]。此外，Keap1/Nrf2/ARE作为氧化应激中重要的信号通路之一，是防御外源物质和细胞氧化损伤，减少氧化应激和介导抗氧化的主要途径^[18-19]，其中，Keap1蛋白含有半胱氨酸残基，这些残基在维持细胞氧化还原平衡方面起着至关重要的作用；转录因子Nrf2是抵御细胞环境压力的核心，在氧化应激中具有中心地位。在正常情况下，Keap1与Nrf2结合锚定在细胞质内，使Nrf2处于非活性状态。而在氧化应激下，Nrf2与其负调控因子Keapl脱离，并从细胞质转移至细胞核中^[20]。Nrf2在细胞核内调节与DNA上的抗氧化反应元件ARE结合，上调可以催化体内多种抗氧化途径的下游基因HO-1的转录和表达^[21], 清除体内过量ROS抵抗氧化应激, 从而起到细胞保护作用。本研究结果显示：ABP-A干预后，模型小鼠脑组织中Keap1表达水平下调，且Nrf2和HO-1表达水平上调，表明ABP-A抗衰老作用与激活Keap1/Nrf2/ARE信号通路有关联。

综上所述，ABP-A可以改善D-Gal诱导的衰老过程中的小鼠脑损伤，提高机体内的抗氧化酶活性，并降低脂质过氧化，具有明显的抗衰老作用，其抗衰活性可能与激活Keap1/Nrf2/ARE信号转导途径有关。本研究为ABM作为保健品和药品原料的研究提供了理论依据，对促进ABM的产业化深度开发具有重要意义。