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文章信息
- 冯杰, 任立群, 陈素贤, 万义增, 徐培斌
- FENG Jie, REN Liqun, CHEN Suxian, WAN Yizeng, XU Peibin
- 葫芦素B联合奥沙利铂对人结肠癌SW480细胞增殖和凋亡的抑制作用及其机制
- Inhibitory effects of cucurbitacin B combined with oxaliplatin on proliferation and apoptosis of human colon cancer SW480 cells and their mechanisms
- 吉林大学学报(医学版), 2020, 46(01): 78-83
- Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2020, 46(01): 78-83
- 10.13481/j.1671-587x.20200114
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文章历史
- 收稿日期: 2019-02-27
2. 锦州医科大学附属第三医院病理科, 辽宁 锦州 121000;
3. 吉林大学药学院实验药理与毒理教研室, 吉林 长春 130021;
4. 长春中医药大学中医学教研室, 吉林 长春 130117
2. Department of Pathology, Third Affiliated Hospital, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, China;
3. Department of Experimental Pharmacology and Toxicology, School of Pharmacy, Jilin University, Changchun 130021, China;
4. Department of Traditional Chinese Medicine, Changchun Universsity of Chinese Medicine, Changchun 130117, China
结肠癌是常见的恶性肿瘤之一,起病隐匿,易发生远处转移,发现时多为中晚期。奥沙利铂(oxaliplatin,OXA)是周期非特异性抗肿瘤药物,可抑制肿瘤细胞增殖,常用于治疗结肠癌,但长期使用会产生肾毒性、耳毒性和骨髓抑制等不良反应,降低了患者的生活质量[1]。因此,减轻OXA的不良反应,提高患者生存质量是治疗结肠癌的关键。中药对肿瘤细胞有抑制作用,因价格低廉、安全无毒,受到人们的高度关注。葫芦素B(cucurbitacin B, CUB)是葫芦素家族成员之一,一种高度氧化的四环三萜类化合物。国内外研究[2-9]显示:CUB对胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、骨肉瘤和淋巴瘤等多种肿瘤有抑制作用。目前国内外尚无CUB联合OXA对结肠癌SW480细胞增殖的影响及机制的相关研究。本研究通过体外实验观察CUB联合OXA对结肠癌SW480细胞增殖及凋亡的影响,探讨其作用机制,为临床治疗结肠癌提供更多的实验依据。
1 材料与方法 1.1 细胞、主要试剂和仪器人结肠癌SW480细胞株(吉林大学药学院提供)。CUB(南京景竹生物科技有限公司),用二甲基亚砜(DMSO)溶解,浓度为1mol·L-1,置于-20℃冰箱保存,DMSO的浓度控制在0.1%以下。OXA(江苏恒瑞医药股份有限公司),用时现配制成100μmol·L-1。DMEM高糖培养液(美国Hyclone公司),优质胎牛血清(天津灏洋生物制品科技有限责任公司),DMSO、噻唑蓝(MTT)和碘化啶(PI)(美国Sigma公司),Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡检测试剂盒、总蛋白提取试剂盒、细胞裂解液、ECL发光液和Hoechst33258染色液(中国碧云天公司),半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3(cysteiyl aspartate specific protease-3,caspase-3)抗体、活化后的caspase-3(cleaved caspase-3)抗体、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗体和Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)抗体(美国Abcam公司),HRP标记的山羊抗兔/鼠二抗(北京鼎国昌盛公司)。倒置相差显微镜(日本尼康公司),DG5031型酶联免疫检测仪(南京华东电子集团医疗装备有限责任公司),电泳槽、流式细胞仪和CO2培养箱(美国SIM公司),Tanon 4600全自动化学发光图像分析系统(上海Tanon科技有限公司)。
1.2 细胞培养和分组SW480细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液培养,置于37℃、5%CO2恒温箱中培养,每2~3d传代1次。将细胞分为对照组, 10、20和40μmol·L-1CUB组,OXA组(100μmol·L-1)和联合组(40μmol·L-1 CUB + 100μmol·L-1OXA)。
1.3 MTT法检测SW480细胞增殖率用0.25%胰酶消化对数生长期的SW480细胞,按每孔5×103个细胞接种于96孔板中,每组设6个复孔。次日,按照实验分组加药,培养24 h,每孔加入MTT 20μL(5g·L-1),继续培养4h,每孔加入DMSO 150 μL,摇床10min。设调零孔,选择490nm波长,用酶标仪测定各孔吸光度(A)值,计算细胞增殖率。细胞增殖率=实验组A值/对照组A值×100%。实验重复3次。
1.4 Hoechst33258染色法观察SW480细胞形态表现将对数生长期的结肠癌SW480细胞接种于6孔板中,分组同上,每孔4×105个细胞。加药培养24h,PBS洗3遍;加入10%甲醛4℃固定15min;加入Hoechst33258染色液,室温孵育2min;封片后用荧光显微镜观察细胞形态表现,Images Advanced3.2成像系统处理图片。实验重复3次。
1.5 流式细胞术检测SW480细胞周期和细胞凋亡率将对数生长期的结肠癌SW480细胞接种于6孔板中,分组同上,每孔4×105个细胞。加药培养24h后收集细胞,1000g离心5 min;1 mL PBS洗涤后,加入1.0mL 70%乙醇溶液4℃固定过夜;1000g离心5min,预冷PBS洗2遍;加入0.6mL PI染液,避光孵育30min,在1h内上流式细胞仪检测不同细胞周期细胞百分率。实验重复3次。
细胞分组同上。培养24h后收集细胞,1000g离心5 min,弃培养液,按照AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作。在室温下避光孵育10min,在30min内采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。实验重复3次。
1.6 Western blotting法检测SW480细胞中caspase-3、cleavedcaspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达水平按照1.5进行分组和加药,24h后提取细胞蛋白,BCA法检测蛋白浓度;SDS-PAGE凝胶电泳,统一蛋白上样量30μg,转移至PVDF膜上;封闭液封闭1h,加一抗4℃过夜;次日加HRP标记的二抗,摇床1h,TBST缓冲液20min/次洗3次,加ECL发光液,实验重复3次。通过Tanon 4600全自动化学发光图像分析系统显影拍摄照片,用ImageProPlus6.0软件分析caspase-3、cleavedcaspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的灰度值, 以GAPDH为内参对照,计算蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值。
1.7 统计学分析采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。各组细胞增殖率、不同细胞周期细胞百分率、细胞凋亡率及各组细胞中caspase-3、cleavedcaspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达水平和cleavedcaspase-3/caspase-3、Bcl-2/Bax比值均符合正态分布, 以x±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK-q检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组SW480细胞增殖率与对照组比较,不同剂量CUB组、OXA组和联合组SW480细胞增殖率明显降低(P < 0.05);与不同剂量CUB组和OXA组比较,联合组细胞增殖率进一步降低(P < 0.05)。见表 1。
(n=3, x±s, η/%) | |||||||||||||||||||||||||||||
Group | Proliferation rate | ||||||||||||||||||||||||||||
Control | 99.51±1.47 | ||||||||||||||||||||||||||||
CUB (μmol·L-1) | |||||||||||||||||||||||||||||
10 | 85.95±2.40* | ||||||||||||||||||||||||||||
20 | 75.97±2.98* | ||||||||||||||||||||||||||||
40 | 60.75±4.51* | ||||||||||||||||||||||||||||
OXA | 62.77±1.75* | ||||||||||||||||||||||||||||
Combination | 36.61±2.45*△#○□ | ||||||||||||||||||||||||||||
* P < 0.05 compared with control group; △ P < 0.05 compared with 10 μmol·L-1CUB group; # P < 0.05 compared with 20 μmol·L-1CUB group; ○ P < 0.05 compared with 40 μmol·L-1CUB group; □ P < 0.05 compared with OXA group. |
Hoechst33258染色后观察SW480细胞形态表现:对照组细胞的细胞核蓝色荧光分布均匀;CUB组和OXA组细胞蓝色荧光较对照组亮,细胞核可见浓染致密的颗粒块状荧光;与CUB组和OXA组比较,联合组细胞蓝色荧光更亮,细胞核浓染颗粒更明显。见图 1(插页五)。
2.3 各组不同细胞周期SW480细胞百分率与对照组比较,不同剂量CUB组和联合组G2/M期细胞百分率明显升高(P < 0.05),OXA组、40 μmol·L-1 CUB组和联合组S期细胞百分率明显升高(P < 0.05)。见图 2(插页六)和表 2。
(n=3, x±s, η/%) | |||||||||||||||||||||||||||||
Group | G1/G0 | S | G2/M | ||||||||||||||||||||||||||
Control | 73.96±1.60 | 19.30±0.44 | 6.74±1.38 | ||||||||||||||||||||||||||
CUB(μmol·L-1) | |||||||||||||||||||||||||||||
10 | 42.91±1.82 | 15.02±2.32 | 42.07±3.78* | ||||||||||||||||||||||||||
20 | 36.64±1.73 | 14.35±1.16 | 49.01±0.71* | ||||||||||||||||||||||||||
40 | 52.68±1.87 | 21.53±1.78* | 24.80±2.65* | ||||||||||||||||||||||||||
OXA | 29.10±1.23 | 64.60±1.40* | 6.28±1.41 | ||||||||||||||||||||||||||
Combination | 43.91±1.39 | 25.70±2.10* | 30.44±1.15* | ||||||||||||||||||||||||||
* P < 0.05 compared with control group. |
与对照组比较,不同剂量CUB组、OXA组和联合组细胞凋亡率明显升高(P < 0.05);与不同剂量CUB组和OXA组比较,联合组细胞凋亡率进一步升高(P < 0.05)。见图 3和表 3。
(n=3, x±s, η/%) | |||||||||||||||||||||||||||||
Group | Apoptotic rate | ||||||||||||||||||||||||||||
Control | 16.08±3.80 | ||||||||||||||||||||||||||||
CUB (μmol·L-1) | |||||||||||||||||||||||||||||
10 | 27.93±1.39* | ||||||||||||||||||||||||||||
20 | 49.13±3.55* | ||||||||||||||||||||||||||||
40 | 63.75±2.62* | ||||||||||||||||||||||||||||
OXA | 60.04±3.78* | ||||||||||||||||||||||||||||
Combination | 78.96±3.88*△#○□ | ||||||||||||||||||||||||||||
* P < 0.05 compared with control group; △ P < 0.05 compared with 10 μmol·L-1CUB group; # P < 0.05 compared with 20 μmol·L-1CUB group; ○ P < 0.05 compared with 40 μmol·L-1CUB group; □ P < 0.05 compared with OXA group. |
与对照组比较,不同剂量CUB组、OXA组和联合组SW480细胞中caspase-3和Bcl-2蛋白表达水平及Bcl-2/Bax比值明显降低(P < 0.05),cleaved caspase-3和Bax蛋白表达水平及cleaved caspase-3/caspase-3比值明显升高(P < 0.05);与不同剂量CUB组和OXA组比较,联合组细胞中caspase-3和Bcl-2蛋白表达水平及Bcl-2/Bax比值明显降低(P < 0.05),cleaved caspase-3和Bax蛋白表达水平及cleaved caspase-3/caspase-3比值明显升高(P < 0.05)。见图 4和表 4。
(n=3, x±s) | |||||||||||||||||||||||||||||
Group | Caspase-3 | Cleaved caspase-3 | Bcl-2 | Bax | Cleaved caspase-3/caspase-3 | Bcl-2/Bax | |||||||||||||||||||||||
Control | 1.25±1.98 | 0.45±1.75 | 2.42±1.82 | 0.50±2.34 | 0.36±1.22 | 2.32±3.26 | |||||||||||||||||||||||
CUB(μmol·L-1) | |||||||||||||||||||||||||||||
10 | 0.87±1.03* | 0.62±2.28* | 1.48±1.96* | 0.71±3.47* | 0.69±2.84* | 1.48±1.43* | |||||||||||||||||||||||
20 | 0.68±3.54* | 0.69±1.45* | 1.14±2.10* | 0.76±1.45* | 1.01±2.3* | 1.08±2.64* | |||||||||||||||||||||||
40 | 0.62±1.62* | 0.93±4.51* | 0.81±4.63* | 0.89±2.72* | 1.37±4.53* | 0.78±3.22* | |||||||||||||||||||||||
OXA | 0.53±2.16* | 1.01±2.56* | 0.62±5.32* | 0.96±3.51* | 1.51±2.17* | 0.74±1.25* | |||||||||||||||||||||||
Combination | 0.38±2.38*△#○□ | 1.14±4.71*△#○□ | 0.34±4.12*△#○□ | 1.42±1.22*△#○□ | 2.38±1.20*△#○□ | 0.39±1.83*△#○□ | |||||||||||||||||||||||
* P < 0.05 compared with control group; △ P < 0.05 compared with 10 μmol·L-1CUB group; # P < 0.05 compared with 20 μmol·L-1CUB group; ○ P < 0.05 compared with 40 μmol·L-1CUB group; □ P < 0.05 compared with OXA group. |
细胞凋亡是由基因控制的一种自主性死亡,肿瘤细胞的无限增殖使得肿瘤细胞无法凋亡。因此,治疗结肠癌的关键是抑制结肠癌细胞增殖,促进结肠癌细胞凋亡。OXA是治疗结肠癌的常用化疗药物,但不良反应明显,降低了患者的生存质量。因此,寻找高效低毒、增强药物疗效及减轻药物不良反应的新药物极其重要。CUB是广泛存在于葫芦科植物中的一类四环三萜类化合物,具有多种药理作用,如抗病毒、抗炎、抑制细胞生长和降血糖等[10],对肿瘤细胞的促凋亡作用引起人们的密切关注。本研究采用不同浓度CUB、OXA及CUB联合OXA作用于人结肠癌SW480细胞,MTT法检测结果显示:与对照组比较,各加药组细胞增殖率明显降低,提示CUB、OXA及两药联合能够诱导细胞凋亡;流式细胞术检测结果显示:与对照组比较,各加药组细胞凋亡率升高,且联合组细胞凋亡率明显高于CUB组和OXA组。研究[11]显示:CUB可将乳腺癌细胞阻滞在S期和G2/M期,诱导细胞凋亡,且能增加药物对细胞的灵敏性。本研究采用流式细胞术检测SW480细胞周期分布,结果显示:与对照组比较,CUB组和联合组细胞中S期和G2/M期细胞百分率升高,OXA组细胞中S期细胞百分率升高。
Bcl-2家族在细胞凋亡中起重要作用,其中Bcl-2基因抑制肿瘤细胞凋亡,Bax基因促进肿瘤细胞凋亡;Bcl-2与Bax既可形成同源二聚体也可形成异源二聚体。当Bcl-2水平升高时,抑制细胞凋亡;Bax水平升高时,促进细胞凋亡[12-13]。有研究[14]显示:结肠癌细胞中Bcl-2表达水平升高,Bcl-2升高抑制Bax表达,进而抑制细胞凋亡。半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteinylaspartate specific protease,caspase)在细胞凋亡中起促进作用[15],其中caspase-3在细胞凋亡过程中是最关键的执行者,是caspase家族中的重要成员[16-17]。细胞凋亡分为受体依赖性途径和线粒体途径[18];当线粒体受刺激时,如感染和DNA损伤,线粒体膜通透性增加,细胞色素C将通过线粒体膜进入细胞质,与凋亡酶激活因子1(apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1)结合,激活半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶9(cysteinylaspartate specific protease-9,caspase-9),caspase-9活化下游的无活性的caspase-3,激活caspase-3剪切成有活性的cleavedcaspase-3,进一步激活caspase的级联反应,诱导细胞凋亡[19-20]。Bcl-2家族可调控caspase的活化和灭活[21]。本研究采用Western blotting法检测各组SW480细胞中caspase-3、cleavedcaspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表达水平,结果显示:与对照组比较,各加药组caspase-3和Bcl-2蛋白表达水平降低,cleavedcaspase-3和Bax蛋白表达水平升高;与CUB组和OXA组比较,联合组细胞中上述蛋白表达水平变化更加明显,提示CUB可以促进cleavedcaspase-3和Bax蛋白表达,抑制caspase-3和Bcl-2蛋白表达,上调cleavedcaspase-3/caspase-3比值,下调Bcl-2/Bax比值,诱导SW480细胞凋亡。
综上所述,CUB能够抑制结肠癌SW480细胞增殖,CUB联合OXA抑制作用更加明显。CUB联合OXA的具体抗肿瘤机制还有待后续研究,且联合用药在动物体内是否具有抑癌作用还有待进一步研究。
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