吉林大学学报(医学版)  2019, Vol. 45 Issue (06): 1454-1458     DOI: 10.13481/j.1671-587x.20190645

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梁小波, 吴德洪, 王星, 张沄, 王孝芸, 李国平
LIANG Xiaobo, WU Dehong, WANG Xing, ZHANG Yun, WANG Xiaoyun, LI Guoping
鼻内滴注烟草提取物和脂多糖建立慢性阻塞性肺疾病小鼠模型的评价
Evaluation on mouse models of chronic obstructive pulmonary disease induced by intranasal instillation of cigarette smoke extract and lipopolysaccharide
吉林大学学报(医学版), 2019, 45(06): 1454-1458
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2019, 45(06): 1454-1458
10.13481/j.1671-587x.20190645

文章历史

收稿日期: 2019-04-02
鼻内滴注烟草提取物和脂多糖建立慢性阻塞性肺疾病小鼠模型的评价
梁小波1 , 吴德洪2 , 王星3 , 张沄1 , 王孝芸3 , 李国平2,3     
1. 西南医科大学附属医院呼吸内一科, 四川 泸州 646000;
2. 四川省成都市第三人民医院呼吸内科, 四川 成都 610031;
3. 西南医科大学附属医院炎症与变态反应实验室, 四川 泸州 646000
[摘要]: 目的 建立鼻内滴注烟草提取物(CSE)和脂多糖(LPS)制备慢性阻塞性肺疾病(COPD)小鼠模型,并探讨其可行性。方法 24只C57BL/6J雄性小鼠随机分为对照组和模型组,每组12只,鼻内滴注CSE和LPS建立COPD小鼠模型,测定2组小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数、中性粒细胞数和巨噬细胞数,观察2组小鼠肺组织病理学表现并测定PAS阳性细胞数、肺泡平均内衬间隔(MLI)和肺泡破坏指数(DI),Western blotting法检测2组小鼠肺组织中E-cadherin、Vimentin和α-SMA蛋白表达水平。结果 实验4和6周时模型组小鼠BALF中细胞总数、中性粒细胞数和巨噬细胞数明显高于对照组(P < 0.01),模型组小鼠肺组织出现典型粘液高分泌和肺气肿改变;实验4和6周时模型组小鼠PAS阳性细胞数、肺泡MLI(P < 0.01)和DI(P < 0.01)明显高于对照组;与对照组比较,实验4和6周时模型组小鼠肺组织中E-cadherin蛋白表达水平降低(P < 0.01),Vimentin和α-SMA蛋白表达水平升高(P < 0.01)。结论 采用鼻内滴注CSE和LPS的方法可在较短时间内建立COPD小鼠模型。
关键词: 慢性阻塞性肺疾病    疾病模型, 动物    烟草提取物    脂多糖    支气管肺泡灌洗液    
Evaluation on mouse models of chronic obstructive pulmonary disease induced by intranasal instillation of cigarette smoke extract and lipopolysaccharide
LIANG Xiaobo1 , WU Dehong2 , WANG Xing3 , ZHANG Yun1 , WANG Xiaoyun3 , LI Guoping2,3     
1. Department of Respiratory Disease, Affiliated Hospital, Southwest Medical University, Luzhou 646000, China;
2. Department of Respiratory Disease, Third People's Hospital, Chengdu City, Sichuan Province, Chengdu 610031, China;
3. Inflammation and Allergic Diseases Research Unit, Affiliated Hospital, Southwest Medical University, Luzhou 646000, China
[ABSTRACT]: Objective To constract the mouse models of chronic obstructive pulmonary disease(COPD) induced by intranasal instillation of cigarette smoke extract(CSE) and lipopolysaccharide(LPS), and to explore its feasibility. Methods Twenty-four C57BL/6J male mice were randomly divided into control group and model group, and there were 12 mice in each group. The COPD mouse model was established by intranasal instillation of CSE and LPS. The number of total cells, neutrophils and macrophages in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) of the mice in two groups were determined, the pathological changes of lung tissue of the mice in two groups were observed, and the number of PAS positive cells, alveolar mean lining interval (MLI) and alveolar damage index (DI) (P < 0.01)of the mice in two groups were determined.Western blotting method was used to detect the expression levels of E-cadherin, Vimentin, and α-SMA proteins in lung tissue of the mice in two groups. Results The number of total cells, neutrophilis and macrophages in BALF of the mice in model group at 4 and 6 weeks of experiment was significantly higher than those in control group (P < 0.01), and the typical mucus hypersecretion and emphysema in lung tissue of the mice in model group were found; the number of PAS positive cells, MLI(P < 0.01), and DI(P < 0.01) of the mice in model group at 4 and 6 weeks were higher than those in control group.Compared with control group, the expression level of E-cadherin protein in lung tissue of the mice in model group was decreased(P < 0.01), and the expression levels of Vimentin and α-SMA proteins in lung tissue of the mice in model group were increased(P < 0.01). Conclusion The mouse model of COPD is successfully established by intranasal instillation of CSE and LPS in a short period of time.
KEYWORDS: chronic obstructive pulmonary disease    disease model, animal    cigarette smoke extract    lipopolysaccharide    bronchoalveolar lavage fluid    

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)简称慢阻肺,是一种以持续性呼吸系统症状和气流受限为特征的慢性炎症性疾病,其病理改变主要表现为慢性气道炎症、黏液高分泌、气道重塑和肺气肿[1-2]。肺功能检查是诊断和评估COPD严重程度的重要手段,持续暴露于香烟烟雾等有毒颗粒或气体而引起的小气道病变和肺泡结构破坏是导致COPD患者肺功能进行性降低的主要原因,气道重塑是引起慢性气流受限的重要原因,上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在气道重塑发展过程中起重要作用[2-5]。目前COPD的发病机制尚未完全阐明,构建COPD动物模型有助于对其发病机制的研究,理想的COPD动物模型应在发病机制、病理变化、肺功能损害和系统性并发症等方面与人类COPD相似,然而,目前已知的动物模型仅能满足上述部分条件。因此,探索建立符合COPD发生发展规律和病理特征的动物模型对于深入研究COPD的发病机制有重要意义。综合文献[1, 6]报道,本研究通过鼻内滴注烟草提取物(cigarette smoke extract, CSE)和脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)建立COPD小鼠模型,探讨该方法制备COPD小鼠模型的可行性。

1 材料与方法 1.1 实验动物、主要试剂和仪器

6~8周龄SPF级C57BL/6J雄性小鼠(20~25 g)24只(重庆腾鑫生物技术有限公司),饲养于西南医科大学动物实验中心SPF级动物房。天下秀(金)香烟(川渝中烟工业有限公司, 含焦油13 mg、烟碱1.1 mg、烟气一氧化碳13 mg)。LPS(美国Sigma公司),E-cadherin抗体、α-SMA抗体和山羊抗大鼠二抗(英国Abcom公司),β-actin抗体、Vimentin抗体、驴抗小鼠二抗和小鼠抗兔二抗(美国Santa Cruz公司),Western和IP裂解液(美国Thermo公司),BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(中国Beyotime公司),PVDF膜(美国Millipore公司),ECL化学发光底物(美国Bio-Rad公司)。垂直电泳槽和凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 CSE的制备

依次点燃2支去过滤嘴香烟,负压下通过装有4 mL PBS的香烟烟雾收集瓶,待香烟烟雾完全溶解后,以0.22 μm过滤器除去细菌和大颗粒物质,以1 mmol·L-1 NaOH将pH调至7.2~7.4。CSE于每次实验前半小时新鲜制备。

1.3 实验分组和模型建立

24只C57BL/6J雄性小鼠按随机数字表法分为对照组和模型组,每组12只。模型组小鼠以戊巴比妥钠60 mg·kg-1麻醉后经鼻滴入CSE,每次30 μL,每周5次,连续4周或6周;然后给予1 g·L-1 LPS,每次10 μL,每周2次,连续4或6周。对照组小鼠同期给予等量PBS。小鼠均饲养于SPF动物中心,符合生物实验伦理委员会要求。造模完成后,以过量戊巴比妥钠处死小鼠。

1.4 支气管肺组织取材和处理

过量戊巴比妥钠处死小鼠后暴露气管并插管,经气管插管分3次注入预冷无菌PBS,每次0.8 mL,收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)。打开胸腹腔,充分暴露心肺并离断腹主动脉,5 mL注射器插入右心室冲洗肺循环血管内血液。取出小鼠左肺以4%甲醛固定,常规石蜡包埋切片,进行HE染色和PAS染色;右肺置于液氮快速冷冻后-80℃保存,待后续提取总蛋白行Western blotting检测。

1.5 2组小鼠BALF中细胞总数和分类计数

收集2组小鼠的BALF以1 500 r·min-1、4℃离心10 min。100 μL PBS重悬,取10 μLBALF计数细胞总数,另取45 μL细胞悬液涂片,干燥后进行瑞氏染色并计数细胞总数、中性粒细胞和巨噬细胞数。

1.6 HE和PAS染色观察2组小鼠肺泡破坏和气道粘液分泌情况

2组各取3张小鼠肺组织HE染色切片,采用Image-Pro Plus6.0图像分析软件测量肺泡平均内衬间隔(mean lining interval, MLI)和肺泡破坏指数(damage index, DI)。2组各取3张小鼠肺组织PAS染色切片,统计PAS染色阳性细胞百分比,PAS染色阳性细胞百分比=PAS染色阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.7 Western blotting法检测2组小鼠肺组织中E-cadherin、Vimentin和α-SMA蛋白表达水平

液氮预冷研钵和研杵,2组各取约100 mg小鼠肺组织置于研钵中研磨,并不断加入液氮,待肺组织研磨成粉末后加入500 μL蛋白裂解液混匀,转入1.5 mL无菌EP管中,冰上静置5 min后离心10 min(4℃、12 000 r·min-1),将上清液转移至新EP管,即为肺组织蛋白提取物,每100 μL肺组织蛋白提取物中加入25 μL 5×Loading Buffer,95℃变性10 min,-20℃保存,采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定各组小鼠肺组织中蛋白水平。制备10% SDS-PAGE凝胶,每孔加入30 μg蛋白样品,先采用80 V恒压电泳,当样品刚进入分离胶时改为100 V,当染料至分离胶底线时停止电泳;100 mA恒流转膜4.5 h,将分离的蛋白转移到PVDF膜;TBST洗膜3次,每次5 min,加入5%脱脂牛奶封闭液,于摇床上室温封闭2 h;TBST漂洗3次,分别采用E-cadherin(1:800)、Vimentin(1:200)、α-SMA(1:800)和β-actin(1:200)一抗,4℃孵育过夜;TBST漂洗3次,采用相应二抗4℃孵育2 h,TBST漂洗3次。在PVDF膜上加入发光液后于BIO-RAD凝胶成像仪曝光并提取图片,利用AlphaEaseFC软件分析目的条带相对灰度值(以β-actin为内参),分别以E-cadherin/β-actin、Vimentin/β-actin和α-SMA/β-actin比值表示E-cadherin、Vimentin及α-SMA蛋白表达水平。

1.8 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。2组小鼠BALF中细胞总数、中性粒细胞数和巨噬细胞数、MLI、DI、2组小鼠肺组织中E-cadherin、Vimentin及α-SMA蛋白表达水平以x±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用Tukey-Kramer法检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组小鼠BALF中细胞总数和分类计数及肺组织病理形态表现

与对照组比较,实验4和6周时模型组小鼠BALF中细胞总数、中性粒细胞数和巨噬细胞数均升高(P < 0.01)。HE染色结果显示:与对照组比较,实验4和6周COPD模型组小鼠支气管周围均有少量炎症细胞浸润,肺泡壁变薄,肺泡不同程度扩张,部分肺泡间隔断裂,融合成肺大疱,肺泡数量减少,Image-Pro Plus6.0图像分析软件测量肺泡MLI和肺泡DI,实验4和6周时模型组小鼠MLI和DI均较对照组明显升高(P < 0.01),且以6周模型组更为显著。PAS染色结果显示:与对照组比较,实验4和6周时模型组小鼠支气管上皮杯状细胞均增生,黏液分泌增加,部分管腔黏液栓形成,PAS染色阳性细胞百分比较对照组均升高,且以6周模型组升高最为明显。见图 1(插页八)和表 12

图 1 2组小鼠肺组织病理形态表现(×200) Fig. 1 Pathomorphology of lung tissue of mice in two groups(×200)
表 1 2组小鼠BALF中细胞总数、中性粒细胞数和巨噬细胞数 Tab. 1 Number of total cells, neutrophils and marcophages in BALF of mice in two groups
(n=6, x±s, ×104 mL-1)
Group No.oftotal cells No.ofneutrophils No.of macrophages
(week) 4 6 4 6 4 6
Control 6.38±1.08 6.79±0.80 0.93±0.09 0.94±0.17 4.50±0.59 4.79±0.83
Model 41.33±4.35* 42.96±3.64* 9.22±1.19* 9.91±1.02* 27.33±2.47* 27.00±2.69*
*P<0.01 compared with control group.
表 2 2组小鼠肺泡MLI和DI Tab. 2 Alveolar MLI and DI of mice in two groups
(n=6, x±s)
Group MLI(l/μm) DI(η/%)
(week)4 6 4 6
Control 22.23±1.62 22.94±2.46 11.16±1.34 11.37±1.09
Model 32.53±1.61* 40.10±2.49* 20.44±1.15* 26.32±1.17*
*P<0.01 compared with control group.
2.2 2组小鼠肺组织中E-cadherin、Vimentin和α-SMA蛋白表达水平

与对照组比较,实验4和6周时模型组小鼠肺组织中E-cadherin蛋白表达水平减少(P<0.01),Vimentin和α-SMA蛋白表达水平升高(P<0.01)。与4周比较,6周时模型组小鼠肺组织中E-cadherin蛋白表达水平降低,Vimentin和α-SMA蛋白表达水平升高,但差异均无统计学意义(P>0.05)。见图 2表 3

图 2 Western blotting法检测2组小鼠肺组织中E-cadherin、Vimentin和α-SMA蛋白表达电泳图 Fig. 2 Electrophoregram of expressions of E-cadherin, Vimentin, and α-SMA proteins in lung tissue of mice in two groups
表 3 2组小鼠肺组织中E-cadherin、Vimentin和α-SMA蛋白表达水平 Tab. 3 Expression levels of E-cadherin, Vimentin and α-SMA proteins in lung tissue of mice in two groups
(n=6, x±s)
Group E-cadherin Vimentin α-SMA
(week) 4 6 4 6 4 6
Control 1.001±0.053 1.086±0.065 0.107±0.005 0.108±0.014 0.125±0.021 0.115±0.017
Model 0.602±0.035* 0.297±0.018* 0.584±0.056* 0.902±0.046* 0.593±0.021* 0.817±0.031*
*P<0.01 compared with control group.
3 讨论

COPD的发病机制至今仍存在许多争议,目前缺乏有效的治疗手段阻止或逆转疾病的进展,肺功能进行性下降,对患者的生存质量和经济负担造成了严重影响。通过对COPD动物模型的构建和研究,深入探索COPD的发病机制,将有助于寻找COPD新型药物治疗靶点。吸烟是COPD最重要的危险因素,大多数COPD患者或多或少都有香烟烟雾暴露史,而CSE几乎包含香烟烟雾中的所有成分,是构建COPD动物模型相对理想的刺激物,且容易制备和定量评价[7]。慢性阻塞性肺疾病急性加重(acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease, AECOPD)是COPD患者死亡的重要因素,革兰阴性菌感染是AECOPD的常见诱因[8],革兰阴性菌细胞壁成分LPS可用于模拟AECOPD。小鼠繁殖饲养成本低,其基因组与人类同源性高,许多天然存在的小鼠品系对香烟烟雾均有不同的反应,已逐渐成为制备COPD模型的首选动物[9]。本研究结果显示:实验4和6周时模型组小鼠BALF中均能观察到炎性细胞数增加,且以中性粒细胞和巨噬细胞为主,HE染色也进一步证实支气管周围存在炎症细胞浸润,但4和6周时模型组小鼠BALF中细胞总数和分类计数方面比较差异无统计学意义。病理学检测发现:模型组小鼠气道黏液分泌增加,部分管腔黏液栓形成,诱导肺气肿形成,表现为肺泡壁变薄,肺泡不同程度扩张,部分肺泡间隔断裂,融合成肺大疱,且实验6周时模型组小鼠病理改变更为显著。根据上述病理改变,本文作者认为鼻内滴注CSE和LPS可在6周内成功构建COPD小鼠模型,该方法操作方便,耗时短,成本低,有望成为建立COPD模型的方法之一。

小气道病变是导致COPD患者肺功能进行性下降的主要原因之一,气道重塑在慢性气流受限中起着重要作用。支气管上皮细胞是暴露于香烟烟雾等有害颗粒或气体的第一层解剖学屏障,并通过释放多种促炎介质、杯状细胞增生和黏液高分泌参与气道重塑的启动[10]。EMT是慢阻肺小气道重塑重要的发病机制之一,表现为E-cadherin、ZO-1和β-catenin等上皮细胞标志物表达减少,Vimentin、α-SMA和N-cadherin等间质细胞标志物表达增加[11]。多项研究[12-13]表明:CSE可在人非小细胞肺癌细胞株H358、Ⅱ型肺泡上皮细胞株A549和支气管上皮细胞株BEAS2B中诱导EMT形成。进一步研究[14]表明:既往有吸烟史会降低EGFR突变阳性肺腺癌患者对EGFR-TKIs的敏感性,而且CSE诱导人肺腺癌细胞株PC9细胞发生的EMT可能有助于获得对EGFR-TKIs的耐药性。上述研究表明:CSE可在多种肺上皮细胞中诱导EMT形成。为了评估COPD动物模型气道重塑的程度,本研究检测小鼠肺组织中EMT标志物变化水平结果显示:与对照组比较,模型组小鼠肺组织中E-cadherin蛋白表达水平降低,Vimentin和α-SMA蛋白表达水平升高,且实验6周时模型组小鼠EMT标志物水平变化更为明显。上述研究结果与COPD模型小鼠病理形态学改变一致。故本研究建模方法可以在整体动物中有效诱导EMT,EMT也有望作为评估COPD动物模型气道重塑的指标之一,并为研究COPD动物EMT的发生机制奠定基础。

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