子宫内膜损伤引起宫颈内口或宫腔发生粘连，临床上称为宫腔粘连(intrauterine adhesion，IUA)^[1]。IUA主要临床表现为月经异常和生育障碍，其高不孕率、高流产率和胎盘异常对女性健康造成严重影响，对IUA的有效治疗一直是妇科的焦点问题^[2-3]。目前临床上广泛采用宫腔镜宫腔粘连分离术治疗IUA，但该术式对局部组织的损害会导致术后再粘连的发生，应及时采取措施进行预防^[4]。平滑肌电刺激能够改善组织血流灌注^[5]，目前国内外将盆底平滑肌电刺激疗法应用于IUA术后子宫修复方面的研究甚少。本研究主要观察IUA患者子宫内膜厚度(endometrial thickness, ET)、搏动指数(pulsatility index, PI)、阻力指数(resistance index, RI)、妊娠情况、子宫内膜组织微血管密度(microvessel density, MVD)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表达，探讨宫腔粘连分离术后联合盆底平滑肌电刺激对IUA患者新生血管形成及局部血液循环重建的改善作用。

选择2016年4月—2018年4月有生育意愿且就诊于本院并诊断为中重度IUA患者80例作为研究对象。按随机数字表法分为对照组、药物组、电刺激组和联合组，每组20例。对照组患者行雌孕激素序贯疗法，药物组患者行雌孕激素序贯疗法+阿司匹林治疗，电刺激组患者行雌孕激素序贯疗法联合盆底平滑肌电刺激治疗，联合组患者行雌孕激素序贯疗法+阿司匹林联合盆底平滑肌电刺激治疗。对照组：中度IUA13例，重度IUA7例，年龄20~40岁，平均年龄(31.38±5.61)岁；药物组：中度IUA12例，重度IUA 8例，年龄22~41岁，平均年龄(29.47±5.72)岁。电刺激组：中度IUA13例，重度IUA7例，年龄20~41岁，平均年龄(30.20±4.88)岁；联合组中度IUA11例，重度IUA9例，年龄21~40岁，平均年龄(31.64±6.03)岁。4组患者的性别、年龄和病程等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

患者经过各项临床诊断、B超诊断、腹腔镜检查诊断和病理诊断均符合美国生殖学会(AFS)分类标准，显示IUA面积占宫腔面积>25%即为中度粘连，IUA面积占宫腔面积>75%即为重度粘连。

纳入标准：①各项临床症状均符合中、重度IUA诊断标准者；②血清性激素水平正常者；③3个月内无激素治疗史者；④已经接受保守性腹腔镜评价及手术治疗者；⑤患者充分了解研究内容，均自愿签署知情同意书，并经过医院伦理委员会批准同意。排除标准：①不符合上述诊断标准者；②治疗前3个月接受过激素治疗或性激素水平异常者；③患有子宫肌瘤、内异症、乳腺癌、内膜癌和精神障碍者；④对研究药物严重过敏者；⑤全身性免疫缺陷、肝肾功能不全、异常阴道出血、妊娠和宫内节育器置入者；⑥未签署知情同意书者。

① 雌孕激素序贯疗法：采用戊雌二醇(拜耳医药保健有限公司，批准文号：国药准字J20130009)，4 mg·d^-1，每天早晚2次服用，连续服用28 d，最后7 d加用地屈孕酮片(注册证号:H20130110)。②阿司匹林治疗：术后第1天起，给予患者口服阿司匹林肠溶片，剂量为每次50 mg，每天1次，连续服用28 d。③盆底平滑肌电刺激治疗：采用法国神经肌肉刺激治疗仪Phenix 8 plus(法国Electonic Concept Lignon Innovation公司生产)进行电刺激治疗。患者平卧，将治疗仪的盆底肌肉治疗头涂抹导电膏，置入患者阴道并连接治疗仪A1通道，地线接电极片贴于骨突标志，A2⁺、A2^-、B1⁺、B1^-、B2⁺和B2^-各连接1片导电贴胶片，负极3片导电贴胶片贴于患者下腹部，正极3片导电贴胶片贴于腰骶部与腹部负极相对应位置。治疗参数为频率30 Hz、脉宽500 μs，电流大小以患者感觉肌肉强力收缩且不产生疼痛感。每次治疗30 min。避开月经期，每2d1次，10次1个疗程，共3个疗程。

治疗后按照文献[4]的疗效评价标准对4组IUA患者的治疗效果进行评价。痊愈：月经量增多、月经周期恢复规律，无周期性腹痛，宫腔镜下检查宫腔形态大小恢复正常，双侧输卵管开口可见；显效：患者经期恢复正常、经量增加但未达到以往正常月经量，无周期性少腹痛，宫腔镜显示宫腔形态大小基本恢复，双侧输卵管开口可见，小部分薄膜样粘连；有效：月经量少，经期未完全恢复正常，周期性少腹痛缓解，宫腔与手术前明显增大，但仍有部分粘连，单侧输卵管开口可见；无效：月经未恢复，宫腔镜下观察宫腔形态与治疗前无明显改变。

观察记录4组患者治疗前后月经量改善情况，观察各组IUA患者术后ET、PI、RI和妊娠情况，并进行对比分析。

IUA患者在行粘连分离术和治疗后宫腔镜复查时，在靠近粘连带处取子宫内膜组织适量，采用CD34标记微血管内皮细胞，计数染色的微血管，取5个视野的平均值，记为MVD。

采用RT-qPCR法检测IUA患者子宫内膜中VEGF mRNA表达水平。4组IUA患者在行粘连分离术和治疗后宫腔镜复查时，在靠近粘连带处取子宫内膜组织适量，按TRIzol试剂盒说明书提取各组总RNA，取2 μg总RNA逆转录成cDNA，并于25 μL反应体系中进行反转录反应，体系含cDNA 2 μL，上、下游引物各0.3 μL，2×Hot Star Taq Master 12.5 μL，灭菌去离子水补足至20 μL。PCR扩增程序：95℃、5 min，94℃、60 s，60 ℃、75 s，72 ℃、30 s，共40个循环。引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列：VEGF上游，5′-CAGATTATGCGGATCAAACCTCACC-3′，VEGF下游，5′-CACAGGGAACGCTCCAGGACTTAT-3′，长度为130 bp；β-actin上游，5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCCTTAT-3′，β-actin下游，5′-AG-CCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′，长度为104 bp。采用2^-ΔΔCt法计算VEGFmRNA表达量。

在行粘连分离术和治疗后宫腔镜复查时，在靠近粘连带处取子宫内膜组织，采用Western blotting法检测IUA患者子宫内膜组织中VEGF蛋白表达水平，所有步骤严格按照操作说明书进行，提取并检测总蛋白浓度，取50 μg蛋白用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳2 h，转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，TBST洗膜后5%脱脂牛奶封闭2 h，加入兔抗人VEGF(1: 1000)一抗孵育，4℃过夜。37℃复温1 h，0.1% TBST洗膜，1: 200加入辣根过氧化物酶标记二抗，室温孵育1 h。ECL显影，Quantity One图像分析软件分析目标条带吸光度(A)值，以VEGF条带A值与β-actin条带A值的比值表示VEGF蛋白表达水平。

采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。各组IUA患者疗效以百分比表示，组间比较采用χ²检验；各组IUA患者ET、PI、RI、子宫内膜MVD和子宫内膜组织中VEGF mRNA及蛋白表达水平以x±s表示，均符合正态分布，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q法，各组IUA患者治疗前后ET、PI、RI、子宫内膜MVD和子宫内膜组织中VEGF mRNA和蛋白表达水平比较采用配对t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

4组IUA患者治疗后总有效率比较差异有统计学意义(P < 0.05)。联合组IUA患者总有效率(95.00%)明显高于对照组(60.00%)(P < 0.05)。联合组IUA患者总有效率与药物组(80.00%)和电刺激组(85.00%)比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表 1。

与治疗前比较，治疗后药物组、电刺激组和联合组IUA患者ET明显增加(P < 0.05)，PI和RI明显降低(P < 0.05)。治疗后各组IUA患者ET比较差异无统计学意义(P>0.05)，联合组IUA患者PI和RI明显低于对照组、药物组和电刺激组(P < 0.05)。见表 2。

与治疗前比较，治疗后电刺激组和联合组IUA患者子宫内膜MVD明显升高(P < 0.05)。治疗后各组IUA患者子宫内膜MVD比较差异有统计学意义(P < 0.05)，联合组IUA患者子宫内膜MVD明显高于对照组、药物组和电刺激组(P < 0.05)。见表 3。

与治疗前比较，治疗后对照组、药物组、电刺激组和联合组IUA患者子宫内膜组织中VEGF mRNA和蛋白水平明显升高(P < 0.05)。治疗后联合组IUA患者子宫内膜组织中VEGF mRNA和蛋白水平明显高于对照组、药物组和电刺激组(P < 0.05)。见表 4和图 1。

Lane 1: Control group; Lane 2: Drug group; Lane 3：Electrical stimulation group; Lane 4: Combination group. 图 1 各组IUA患者子宫内膜组织中VEGF蛋白表达电泳图 Fig. 1 Electrophoregram of expressions of VEGF protein in endometrium tissue of IUA patients in various groups

图选项

术后随访6个月后，对照组IUA患者20例试孕，成功妊娠10例，7例足月分娩，2例孕2个月胎心停止；药物组IUA患者20例试孕，成功妊娠12例，9例足月分娩，1例孕2个月胎心停止；电刺激组IUA患者20例试孕，成功妊娠13例，11例足月分娩；联合组IUA患者20例试孕，成功妊娠17例，15例足月分娩。联合组IUA患者妊娠成功率高于对照组、药物组和电刺激组，但组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表 5。

子宫内膜受损是形成IUA的直接因素，主要由于组织基底层损伤后，促使新血管生成，在此过程中，宫腔组织分泌大量炎性因子，导致子宫内膜纤维化的发生^[7-9]。血管生成在IUA形成和子宫内膜修复过程中起重要作用，主要由于组织生长修复过程中需要新的血管供应。VEGF作为内皮细胞特异性血管生成蛋白，参与血管生成的过程，主要通过促进血管内皮细胞活动及血管生长，在新生血管形成过程中起关键作用^[10]。研究^[11]表明：随着子宫内膜的生长，伴随着VEGF受体和配体mRNA表达的明显变化，VEGF mRNA表达水平明显增加。宫腔粘连分离术是目前临床上有效治疗IUA主要方法，该术式在宫腔镜下有目的地分离IUA，以恢复子宫腔和宫颈管的正常形态^[12]。但IUA分离术造成的二次创伤是导致宫腔再粘连发生的主要原因之一，为了预防术后宫腔再粘连，通常采用雌激素或阿司匹林治疗以及放置宫内节育器、抗粘连屏障或子宫气囊支架^[13-16]。阿司匹林是临床常用药物，具有安全、有效的特点，能够促进子宫发育，且具有预防再粘连的作用^[17]。平滑肌电刺激则可采用交感神经系统的动作电位，对局部组织和血管选择性进行刺激，达到改善微循环的目的^[18-19]。另有研究^[20]表明：平滑肌电刺激具有消除自由基、增加局部激素受体敏感性的作用，这对预防IUA的再发生起重要作用。采用盆底平滑肌电刺激，能够调节组织内环境，改善盆腔血循环，促进新陈代谢和组织修复。本研究在宫腔粘连分离术后雌孕激素序贯疗法的基础上，给予阿司匹林和(或)盆底平滑肌电刺激，以探讨其临床意义。本研究结果显示：与治疗前比较，治疗后药物组、电刺激组和联合组IUA患者治疗后ET明显增加，PI和RI明显降低，表明阿司匹林和盆底平滑肌电刺激均能增加ET。电刺激组和联合组IUA患者治疗后子宫内膜MVD明显升高，表明盆底平滑肌电刺激能够改善子宫内膜血管微循环，但阿司匹林对子宫内膜血管微循环影响不明显。对照组、药物组、电刺激组和联合组IUA患者治疗后子宫内膜组织中VEGF mRNA和蛋白水平明显升高，表明雌激素、阿司匹林和盆底平滑肌电刺激对促进VEGF的表达均有一定作用。联合组IUA患者总有效率明显高于对照组，PI和RI明显低于对照组、药物组和电刺激组，子宫内膜MVD值、子宫内膜组织中VEGF mRNA和蛋白水平明显高于对照组、药物组和电刺激组，表明口服阿司匹林联合盆底平滑肌电刺激对预防术后IUA的发生起到协同作用，给予阿司匹林能有效预防子宫术后感染，通过盆底平滑肌电刺激改善组织微循环，二者联合使用共同促进新生血管增殖和修复，有效防止宫腔再粘连发生。联合组与药物组、电刺激组IUA患者妊娠成功率比较差异无统计学意义，可能与样品量少和随访时间短有关，今后研究将增加病例数进一步探讨。

综上所述，宫腔粘连分离术后采用雌孕激素序贯疗法联合阿司匹林及盆底平滑肌电刺激治疗能够明显改善患者ET，增加子宫血液循环，并且提高患者妊娠率，有效预防术后IUA的发生。