脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是主要由交通、工矿事故及运动意外所造成的严重中枢神经系统损伤，具有高发生率、高致残率和低死亡率的特点。现代医学的发展使更多患者从初次SCI中存活下来，但大部分人留有严重残疾，这给患者、家庭和社会带来了沉重的负担。SCI再生修复成为最具挑战性的医学难题之一，积极寻求有效治疗手段具有重要的临床意义。SCI的治疗方法主要包括手术、药物、细胞移植和运动干预等。减重步行训练(body weight support treadmill training，BWSTT)也称跑台运动，其具有有效、经济、简单易行和可持续性强等特点，是目前研究人与动物中枢神经系统损伤后促进功能康复的一种常用运动训练方法^[1-4]。前期研究^[5-7]表明：高强度训练能够提高SCI患者的运动能力，但其具体的作用机制尚不清楚。本研究通过观察BWSTT对SCI模型大鼠脊髓区脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)及其受体酪氨酸蛋白激酶B(tyrosine protein kinase B，TrkB)表达的影响，探讨其促进运动功能恢复的可能机制。

清洁雄性SD大鼠50只，体质量(260±20)g，由大连医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(辽)2018-003。PVDF膜购自美国Millipore公司，兔抗大鼠一抗BDNF(1:1 000)、兔抗大鼠一抗TrkB(1:5 000)、兔抗大鼠一抗β-actin(1:1 000)和山羊抗兔HRP-二抗均购自美国Abcam公司，ECL增强化学发光试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。ChemiDoc^TM XRS+Imager凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司，生物自动脱水机(TP1020)、自动旋转式石蜡切片机(RM2255)、石蜡包埋机(EG1150 H)和分体式独立冷台(EG1150 C)购自德国Leica公司，自制打击器，电热恒温培养箱(DNP-9272)购自上海精宏实验设备有限公司，显微镜(Ci-1)购自日本Tokyo公司，啮齿动物机器人辅助运动操作系统(RRMPS)购自美国Robomedica公司，机器人辅助运动操作系统(robotic rodent motor performance system，RRMPS)机器配套软件(Analysis_V2.1)购自美国Robomedica公司。

大鼠在实验室常规单笼饲养适应1周后，按照随机数字表法分为假手术组(10只)、SCI组(10只)、BWSTT-A组(10只)、BWSTT-B组(10只)和BWSTT-C组(10只)，各BWSTT组大鼠均在SCI后14 d开始采用进行BWSTT，每次15 min，每天1次，每周5 d，训练周期为3周。BWSTT-A组、BWSTT-B组和BWSTT-C组大鼠分别采用低、中和高强度训练，步行速度分别为7、15和21 cm·s^－1。本研究已经通过大连大学医学伦理委员会审批，符合动物伦理原则。

如文献[2]所述，通过腹膜内注射10%水合氯醛(1 mL·kg^－1)麻醉大鼠。将SCI大鼠以仰卧位置放在手术台上，触诊肋骨以定位T10胸椎的棘突。在背部手术区剃掉毛发并用碘伏消毒，然后用精细手术刀做15 mm中线切口，露出T10椎骨的背部，并用骨夹去除T10椎板的棘突和背部，直到脊髓硬膜外暴露。从10 mm的距离下落25 g打击棒直接击中大鼠暴露的脊髓，导致脊髓挫伤。成功挫伤的指标包括局部脊髓发红和肿胀，撞击后立即摇动两肢，大鼠双侧后肢麻痹。然后用手术缝合线将周围组织分层缝合。假手术组大鼠在T10处打开椎板，只暴露脊髓，不打击。手术后，所有大鼠立即置于温水垫上直至恢复意识。手术结束时后所有大鼠连续3 d腹膜内注射青霉素(160 mg·kg^－1)，每天1次，连续3 d，以预防感染。手术次日开始按摩膀胱，每天2次，直到大鼠恢复自动排尿。观察手术切口有无异常、腹部皮肤有无压疮或感染、下肢有无溃烂、排便有无异常等，注意鼠笼清洁卫生，及时更换垫料。每次抓取大鼠动作轻柔，避免牵拉损伤脊髓。

采用BBB评分法^[8]观察各组大鼠髋、膝和踝关节行走、躯干运动及协调情况，记录SCI大鼠BBB评分。

大鼠在实验治疗结束后采用10%水合氯醛腹腔麻醉(3 mL·kg^－1)，断头处死，从损伤中心处迅速切开，取出脊髓组织放入液氮中快速冷冻，－80℃冻存，用于脊髓组织中TrkB和BDNF蛋白表达水平的检测。采用裂解液提取的大鼠脊髓蛋白，然后采用BCA试剂盒定量。SDS-PAGE凝胶上电泳，转移到PVDF膜。PVDF膜在5%脱脂牛奶中室温下封闭1 h，敷一抗兔抗大鼠BDNF(1:1 000)、兔抗大鼠TrkB和兔抗大鼠β-actin，4℃过夜。TBST洗涤3次，每次10 min，然后将膜与山羊抗兔HRP-二抗在室温下孵育1 h。接着在TBST中洗涤3次，每次10 min，通过ECL增强化学发光试剂盒在ChemiDoc^TM XRS+Imager成像系统上显影，通过ImageJ软件分析目标蛋白条带的灰度值，计算目标蛋白表达水平。目标蛋白表达水平=目标蛋白条带的灰度值/内参β-actin的灰度值。

大鼠在实验治疗结束后用10%水合氯醛腹腔麻醉(3 mL·kg^－1)，并经心脏灌注冷盐水和4%多聚甲醛，直至尾部和四肢僵硬。取出脊髓放在4%多聚甲醛瓶中，于4℃冰箱中固定3 d后，经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片和烘干等步骤制备石蜡切片，层厚4 μm。按照尼氏液染色说明书脱蜡、脱水，室温下染色10 min。然后蒸馏水快速冲洗，脱水、透明、封片。在恒定曝光条件下使用显微镜于200倍镜下拍照，观察脊髓神经细胞和尼氏体的形态表现。

采用SPSS 24.0统计软件进行统计学分析。各组大鼠脊髓组织中BDNF和TrkB蛋白表达水平及大鼠BBB评分以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐时采用LSD检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

与SCI组比较，BWSTT-B组和BWSTT-C组大鼠BBB评分升高(P＜0.01)；与BWSTT-A组比较，BWSTT-B组和BWSTT-C组大鼠BBB评分升高(P＜0.01)，其他各组间比较差异均无统计学意义(P＞0.05);可见BWSTT能改善大鼠SCI后肢体运动功能，中和高强度的训练疗效更加显著。见图 1。

*P < 0.01vs SCI group; △P < 0.01 vs BWSTT-A group.1:SCI group; 2:BWSTT-A group; 3:BWSTT-B group; 4:BWSTT-C group. 图 1 各组大鼠BBB评分 Fig. 1 BBB scores of rats in various groups

图选项

与假手术组比较，SCI组大鼠脊髓组织中TrkB蛋白表达水平降低(P < 0.01)；与SCI组比较，BWSTT-B组和BWSTT-C组大鼠脊髓组织中TrkB蛋白表达水平升高(P < 0.01)；BWSTT-B组和BWSTT-C组大鼠脊髓组织中TrkB蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。与假手术组比较，SCI组大鼠脊髓组织中BDNF蛋白表达水平降低(P < 0.01)；与SCI组比较，BWSTT-B组和BWSTT-C组大鼠脊髓组织中BDNF蛋白表达水平均升高(P < 0.01)；BWSTT-B组和BWSTT-C组大鼠脊髓组织中BDNF蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P＞0.05)。脊髓组织中BDNF蛋白表达水平结果表明：中和高强度BWSTT可以提高脊髓组织中BDNF蛋白表达水平。见表 1和图 2。

Lane 1:Sham operation group; Lane 2:SCI group; Lane 3:BWSTT-A group; Lane 4:BWSTT-B group; Lane 5:BWSTT-C group. 图 2 各组大鼠脊髓组织中BDNF和TrkB蛋白表达电泳图 Fig. 2 Electrophoregram of expressions of BDNF and TrkB proteins in spinal cord tissue of rats in various groups

图选项

尼氏染色结果显示：假手术组神经细胞结构正常，尼氏小体数量较多，分布清晰，排列整齐，胞体呈斑驳的蓝紫色染色；SCI组神经细胞结构破坏，胞体肿胀变形或萎缩，细胞核周边尼氏小体肿胀破碎，大量集聚，神经细胞核仁消失；BWSTT-A组神经细胞尼氏小体数量少，胞浆染色变浅，甚至染色已不明显；BWSTT-B组和BWSTT-C组神经细胞形态较好，尼氏小体数量明显增多呈斑块状，胞浆浓染，胞核可见，可见中和高强度BWSTT能降低神经细胞损伤程度，改善神经细胞损伤形态，减少尼氏小体破碎溶解。见图 3(插页六)。

A:Sham operation group；B:SCI group；C:BWSTT-A group；D:BWSTT-B group；E:BWSTT-C group. 图 3 各组大鼠尼氏小体数量和形态表现(尼氏，×200) Fig. 3 Number and morphology of Nissl bodies of rats in various groups(Nissl，×200)

图选项

SCI后脊髓内微环境会发生一系列变化，从而影响脊髓存活和再生^[9]。调整SCI后局部微环境、促进轴突再生和神经功能恢复已成为当前研究的热点。SCI后局部微环境中神经再生相关有利因子和抑制因子相互作用，使SCI后具有条件性再生能力，而且这种再生条件可被运动训练所诱导^[10]，持续的运动训练刺激可以促进中枢神经重塑^[11-13]。

SCI后脊髓内微环境中的有利因子包括神经生长因子和BDNF等。BDNF是一种重要的感觉和运动神经元营养因子，对神经元的生存、分化、生长和维持神经元正常的生理功能起关键作用，刺激诱导轴突再生以及促进神经通路修复。BDNF通过与其受体TrkB结合，启动众多信号通路传导，发挥其促进神经功能的作用^[14-15]。BDNF-TrkB信号传导是运动训练中的关键途径，可促进不完全性SCI大鼠神经功能的恢复^[16]。本研究结果显示：BWSTT-B组和BWSTT-C组大鼠脊髓组织中TrkB和BDNF蛋白表达水平较SCI组升高，提示中和高强度BWSTT能调动内源性TrkB和BDNF的合成增加或者转运增加，促进神经组织的修复功能，对神经组织起保护作用，阻止神经元死亡。雷晓婷等^[10]研究显示:对SCI大鼠分周期进行运动训练，在损伤后相同时间点运动组大鼠脊髓组织中BDNF蛋白水平较损伤非运动组高，并且运动训练组在l4 d以后始终保持较高水平，训练停止后未见明显降低，分析机制认为可能通过上调脊髓中BDNF的表达水平，使脊髓内神经元再生微环境向有利方向转变。SOYA等^[17]研究采用与本研究相似的运动强度探讨运动对神经系统BDNF表达水平的影响，结果与本研究基本一致。LEECH等^[18]还发现：高强度运动可以提高不完全性SCI患者的血清BDNF水平，从而促进神经细胞的生长分化和神经通路重建，改善运动功能。本研究结果显示：低强度运动训练不仅不能上调大鼠脊髓组织中BDNF和TrkB蛋白水平，甚至BDNF的表达水平较不进行运动的SCI组大鼠更低，其引发机制还有待进一步研究。脊髓神经细胞结构和功能完整性是SCI肢体运动功能恢复的基础。SCI后多种不利因素均通过促进神经细胞坏死和凋亡而导致严重的肢体运动功能障碍。尼氏小体广泛存在于神经细胞胞体和树突中，主要分布在胞浆中，染色后可呈蓝紫色，是神经细胞功能活性的形态指标，尼氏小体数量多表明神经细胞合成蛋白质功能较强。在代谢功能旺盛的神经元中尼氏体特别丰富。当神经细胞受到损伤或过度疲劳时尼氏体可减少、解体甚至消失。因此，尼氏体可作为神经细胞功能状态的标志。本研究结果显示：BWSTT-A组神经细胞中尼氏小体数量少，胞浆染色变浅，甚至染色已不明显，而BWSTT-B和BWSTT-C组神经细胞形态较好，尼氏小体数量较多，呈斑块状，胞浆浓染，胞核可见。由此可见，中和高强度BWSTT有助于提高SCI大鼠脊髓组织中尼氏小体的数量，改善神经细胞的形态。

本研究结果显示：与SCI组比较，BWSTT-B组和BWSTT-C组大鼠BBB评分升高；与BWSTT-A组比较，BWSTT-B组和BWSTT-C组大鼠BBB评分升高，其他各组间BBB评分比较差异均无统计学意义; 说明BWSTT能改善大鼠SCI后肢体运动功能，中和高强度BWSTT疗效更加显著。与国内范筱等^[19]和丁晓晶等^[20]的研究结果近似。

综上所述，SCI后采用中和高强度的BWSTT可以明显改善患者的肢体运动功能，其作用机制可能与增加脊髓中TrkB和BDNF蛋白表达水平及尼氏小体数量，从而改善脊髓神经细胞形态和数量、保护受损神经细胞有关。