乳腺癌是全世界女性中最常见的癌症，尽管其死亡率有降低趋势，但其仍然是女性癌症死亡最常见原因之一^[1]。导致乳腺癌发生发展的确切机制尚不十分清楚。目前治疗乳腺癌的主要方式包括手术、放疗和化疗等综合治疗，虽取得了一定的进展，但患者预后仍不理想^[2-3]。随着分子生物学的快速发展，基因治疗在癌症治疗中取得了较显著的疗效，也成为癌症治疗的研究热点^[4]。因此，探讨有效抑制乳腺癌发生发展的分子作用靶点对乳腺癌的基因治疗具有重要意义。TRIM24基因编码的蛋白质属于TRIM家族成员之一，参与细胞增殖、细胞凋亡和细胞周期变化等多种重要生命过程^[5]。目前研究^[6-7]显示：TRIM24基因在胃癌和肝癌等多种肿瘤组织中呈高表达，且与肿瘤恶性发展及预后不良密切相关。因此TRIM24基因可能作为一个潜在的肿瘤基因治疗的分子靶点。最近研究^[8]显示：TRIM24基因在乳腺癌组织中同样呈高表达，但其在乳腺癌发生发展中的功能尚不清楚。本实验通过转染TRIM24 siRNA抑制乳腺癌MCF-7细胞中TRIM24基因的表达，观察抑制TRIM24基因对MCF-7细胞生物学特性的影响，以期为乳腺癌基因治疗提供新的作用靶点。

人乳腺癌MCF-7细胞(中国科学院上海生命科学学院细胞库)。DMEM培养基(美国Gibco公司)，胰蛋白酶和MTT试剂(美国Sigma公司)，特级胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，二甲基亚砜(美国Amresco公司)，RNA提取试剂盒和反转录试剂盒(美国Beckman Coulter公司)，RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒和ECL化学发光试剂等Western blotting相关试剂(上海碧云天生物技术研究所)，鼠抗人TRIM24抗体、鼠抗人GAPDH抗体和山羊抗鼠二抗(美国Abcam公司)，TRIM24 siRNA及阴性对照NC-siRNA(上海吉玛制药技术有限公司)，脂质体转染试剂Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)，qRT-PCR检测试剂盒SYBR Primix^Ex Taq(日本TaKaRa公司)，AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(大连宝生物工程有限公司)，Transwell小室(美国Millipore公司)，Matrigel基质胶(美国BD公司)。

将乳腺癌MCF-7细胞接种于培养瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基(含100 U·mL^-1青霉素和100 U·mL^-1链霉素)，放置于37℃、5%CO₂、相对饱和湿度的培养箱中培养，细胞呈贴壁生长，根据细胞生长状态及时更换培养基，待细胞生长汇合率至80%以上时，采用0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期的MCF-7细胞用于后续实验。

将生长状态良好的MCF-7细胞接种到96孔细胞培养板中，于37℃条件下继续培养24 h，待细胞生长融合至50%时进行转染。实验分为转染TRIM24 siRNA的MCF-7细胞组(si-TRIM24组)、转染阴性对照NC-siRNA的MCF-7细胞组(NC-siRNA组)和未转染的MCF-7细胞组(对照组)。参照脂质体转染试剂Lipofectamine 2000说明书进行转染操作，转染后各组细胞放置于37℃培养箱中继续培养。

分别收集转染48 h后各组MCF-7细胞，使用RNA提取试剂盒提取MCF-7细胞中总RNA，以分光光度计测定吸光度(A)值和提取的RNA浓度和纯度，取A(260)/A(280)比值为1.8~2.1的RNA样品进行逆转录，按照试剂盒说明书合成cDNA。以cDNA为模板，采用SYBR Primix^Ex Taq试剂盒进行qRT-PCR扩增，反应体系为20 μL，反应程序设置为Cycle 1：95℃、5 min，1个循环；Cycle 2：95℃、30 s，60℃、30 s，72℃、20 s，40个循环。以GAPDH为内参，采用2^-ΔΔCt法计算各组MCF-7细胞中TRIM24 mRNA相对表达水平。TRIM24引物：F-5′-TGTGGGAGTTGGTTCTCCTG-3′；R-5′- AGACAGGCAGCAGCAGTTAC-3′；GAPDH引物：F-5′-AATCCCATCACCATC-TTCC-3′；R-5′-CATCACGCCACAGTTTCC-3′。

提取转染48 h后对照组、NC-siRNA组和si-TRIM24组MCF-7细胞中总蛋白。使用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白样品浓度，将蛋白样品与上样缓冲液混合，沸水浴中加热致蛋白变性，配置10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶，取等量变性蛋白样品上样，电泳分离蛋白，转膜后在100 g·L^-1脱脂奶粉中封闭2 h。加入1:1 000稀释的TRIM24一抗，4 ℃过夜杂交，TBST洗膜15 min×3次，加入1:5 000稀释的二抗室温杂交1 h。TBST洗膜15 min×3次，加入ECL化学发光液，显影，定影，曝光，拍照。以GAPDH进行标定，以Image J软件检测各条带灰度值，以目标条带灰度值与GAPDH条带灰度值的比值代表各组MCF-7细胞中TRIM24蛋白表达水平。

将处于对数生长期的MCF-7细胞接种于96孔板中，每孔接种约3×10³个细胞，于37℃培养箱继续培养24 h，按照1.3转染和分组，每组设置5个复孔，分别在转染24、48、72和96 h时向各组每孔细胞中添加20 μL的5 g·L^-1MTT溶液，37℃孵育4 h，除去培养上清液，再加入二甲基亚砜100 μL，混匀后，振荡反应10 min，使用酶标仪测定450 nm波长处A值，实验重复3次，取均值，以A值表示细胞增殖能力。

收集转染后48 h时各组MCF-7细胞，经PBS洗涤2次，离心后收集1×10⁵个细胞，用100 μL Binding Buffer重悬细胞，分别向细胞悬液中添加AnnexinⅤ-FITC和PI各5 μL，混匀后避光反应15 min，再加入400 μL Binding Buffer，1 h内采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率。

Transwell侵袭实验：将Matrigel基质胶用无血清培养基进行稀释，将稀释的Matrigel胶平铺于Transwell小室的上室，室温下凝固备用。收集各组MCF-7细胞，以无血清培养基重悬细胞，制成1×10⁶ mL^-1单细胞悬液，取100 μL单细胞悬液加入到Matrigel包被的Transwell小室的上室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培养基，将Transwell小室放置在37℃培养箱中继续培养48 h，取出小室，用棉签擦去上室未穿膜的细胞，使用结晶紫染色液染色5 min，洗去染色，晾干后在显微镜下(×100)随机选取6个不同视野观察穿膜细胞数，以穿膜细胞数代表示细胞侵袭能力。Transwell迁移实验：Transwell小室以不含Matrigel的基质胶包被，其余实验步骤均同Transwell侵袭实验，以迁移细胞数表示细胞迁移能力。

采用SPSS 21.0统计软件对数据进行统计学分析。各组细胞中TRIM24 mRNA和蛋白表达水平、细胞增殖能力、细胞凋亡率、侵袭和迁移细胞数均以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

si-TRIM24组MCF-7细胞中TRIM24 mRNA和蛋白表达水平较NC-siRNA组和对照组明显降低(P < 0.05)，NC-siRNA组和对照组MCF-7细胞中TRIM24 mRNA和蛋白表达水平比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。见图 1和表 1。

Lane 1: Control group; Lane 2: NC-siRNA group; Lane 3:si-TRIM24 group. 图 1 Western blotting法检测各组MCF-7细胞中TRIM24蛋白表达电泳图 Fig. 1 Electrophoregram of expressions of TRIM24 protein in MCF-7 cells in various groups

图选项

si-TRIM24组MCF-7细胞增殖能力从48 h开始明显低于NC-siRNA组与对照组(P < 0.05)，24、48、72和96 h时NC-siRNA组和对照组MCF-7细胞增殖能力比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。

si-TRIM24组MCF-7细胞凋亡率为(36.48±3.90)%，NC-siRNA组MCF-7细胞凋亡率为(3.03±0.03)%，对照组MCF-7细胞凋亡率为(2.69±0.03)%。si-TRIM24组细胞凋亡率较NC-siRNA组和对照组明显升高(P < 0.05), NC-siRNA组和对照组MCF-7细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见图 3。

*P < 0.05 compared with control group; △P < 0.05 compared with NC-siRNA group. 图 2 MTT实验检测各组MCF-7细胞的增殖能力 Fig. 2 Proliferation abilities of MCF-7 cells in various groups detected by MTT assay

图选项

图 3 流式细胞术检测各组MCF-7细胞凋亡率 Fig. 3 Apoptotic rates of MCF-7 cells in various groups detected by flow cytometry

图选项

si-TRIM24组MCF-7细胞侵袭和迁移细胞数较NC-siRNA组和对照组明显减少(P < 0.05)，NC-siRNA组和对照组MCF-7细胞侵袭及迁移细胞数比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表 2。

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，具有高发病率、高死亡率和高转移性等特性，严重影响女性的健康和生命^[9]。目前，乳腺癌的治疗主要包括手术、化疗、放疗、内分泌和生物治疗。然而手术、化疗和放疗引起的不良反应限制了传统治疗的发展^[10]。因此开发新的乳腺癌治疗方法已成为临床医生的研究重点。乳腺癌的发生发展是一个复杂的过程，许多基因与乳腺癌的发生有关^[11]。研究新的乳腺癌相关基因表达和阐明这种基因表达在乳腺癌中的作用对乳腺癌的诊断、治疗和预防具有重要临床意义。TRIM24基因位于人类7号染色体q32-q34上，其编码的蛋白为TRIM超家族的成员之一^[12]。TRIM24蛋白具有典型的RING保守结构域，是一种核蛋白受体，普遍存在于真核生物中^[13-14]。TRIM24基因在多种肿瘤组织中普遍表达，在食管鳞状细胞癌^[15]、前列腺癌^[16]和肺癌^[17]组织中呈高表达。高侵袭和迁移性肿瘤中TRIM24的表达水平明显升高。FANG等^[18]发现：TRIM24通过Wnt/β-catenin信号通路促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭。TRIM24在宫颈癌组织中过度表达并调节细胞恶性转移，这使得TRIM24成为宫颈癌的候选治疗靶标^[19]。研究^[20]显示：在结直肠癌HCT116细胞中敲低TRIM24表达可明显抑制细胞的生长，诱导细胞凋亡，提示TRIM24基因与肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移等生物学特性密切相关。关于TRIM24基因是否能够调控乳腺癌细胞生物学特性的研究鲜有报道。因此了解TRIM24基因在乳腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移中的作用可为乳腺癌的基因治疗提供实验依据。

本研究通过在乳腺癌MCF-7细胞中转染TRIM24 siRNA抑制TRIM24基因表达，并采用qRT-PCR和Western blotting检测验证转染效果，证实转染TRIM24 siRNA能够有效抑制MCF-7细胞中TRIM24的表达；MTT实验结果显示抑制TRIM24的表达能够明显抑制MCF-7细胞增殖能力；流式细胞术分析结果表明抑制TRIM24的表达可有效提高MCF-7细胞凋亡率；Transwell侵袭和迁移实验表明抑制TRIM24的表达能够减少侵袭和迁移细胞数，提示抑制TRIM24基因表达可促进MCF-7细胞增殖，诱导细胞凋亡，阻碍细胞侵袭和迁移，抑制乳腺癌的进展。本研究在乳腺癌MCF-7细胞中转染TRIM24 siRNA，有效抑制了细胞中TRIM24的表达。然而TRIM24对乳腺癌MCF-7细胞作用的具体分子机制尚不清楚，需行后续实验进一步探讨。本实验观察TRIM24基因对乳腺癌MCF-7细胞生物学特性影响的结果表明：目前只在单一细胞株中研究TRIM24基因对乳腺癌细胞生物学特性的影响尚显不足，后续实验将在多个细胞株中加以验证，同时TRIM24基因用于乳腺癌基因治疗的效果仍需深入研究。