全球范围内肺癌仍位于恶性肿瘤发病率和死亡率的首位。最新的全球癌症统计报告^[1]显示：2018年新增的肺癌病例数为210万人，因肺癌死亡的患者有180万(占癌症死亡人数的18.4%)。小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)约占所有肺癌发病率的14%^[2]，SCLC具有高度侵袭性，且生长速度快，约2/3患者就诊时已处于广泛期。因此深入探讨SCLC发生发展的可能分子机制并寻找可能的潜在干预靶点对SCLC的防治至关重要。SCLC患者血清中Dickkopf-1 (DKK1)蛋白表达水平较高，本文作者推测DKK1可能与SCLC的发生发展、特别是转移有关联。DKK1是一种分泌型的蛋白，是Wnt信号通路的负性调控因子。研究^[3]证实：Wnt信号通路对细胞的增殖和凋亡等发挥着重要作用，其异常调控会引起细胞发育异常及癌变，但DKK1与SCLC的关系目前尚未见相关报道。本研究采用慢病毒感染构建DKK1蛋白过表达的SBC-3细胞株，观察上调DKK1蛋白表达对SBC-3细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响，初步探讨其可能的分子机制。

人SCLC细胞株SBC-3为陕西省肿瘤医院基础实验室保存。RPMI1640和10%胎牛血清购自美国Gibco公司，RNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司，RT-PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司，蛋白定量试剂盒购自美国Thermo公司，DKK1抗体和基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)抗体(兔抗人)购自美国Abcam公司，β-actin(鼠抗人)抗体购自美国Sigma公司，相应的二抗分别购自中杉金桥公司和GeneText公司。慢病毒由吉凯公司合成，PCR引物由上海生工合成。细胞培养瓶和培养板等购自美国Corning公司。其他试剂和仪器为陕西省肿瘤医院内三科实验室保存。

人SCLC SBC-3细胞培养在完全培养基中，置于37 ℃、5% CO₂孵箱中常规培养，待细胞生长至对数期时进行实验。

常规处理处于对数生长期的细胞，采用无血清培养基制成密度为1 × 10⁴mL^-1的细胞悬液，按照每孔2×10⁴个将细胞接种于6孔板中继续培养，细胞密度达20%且细胞状态良好时按照预感染实验结果，当感染复数(multiplicity of infection, MOI)为80时取相应体积的过表达慢病毒及对照病毒，在含有Polybrene的ENi.S感染液中，按照操作步骤进行细胞感染。基因名称：DKK1(NM_012242)，载体名称：GV358，元件顺序：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin。感染24 h后将无血清培养基更换为完全培养基，72 h后倒置荧光显微镜下观察绿色荧光率大于80%提示感染成功。常规扩大培养，并加入1 mg·L^-1嘌呤霉素进行筛选1周。获得稳定表达DKK1蛋白的细胞系(SBC-3-DKK1组)和对照细胞系(SBC-3-NC组)。

根据RNA提取试剂盒的操作流程，分别收集SBC-3-DKK1组和SBC-3-NC组细胞各5 ×10⁶个，加入裂解液Buffer RLT，逐步进行RNA提取。测定RNA浓度和纯度，按照试剂盒说明书进行反转录和RT-PCR实验，以β-actin作为内参，采用2^-ΔΔCT法计算2组细胞中DKK1 mRNA表达水平。

常规裂解SBC-3-DKK1和SBC-3-NC组细胞，提取总蛋白。按照蛋白定量分析试剂盒说明书准确进行蛋白定量并制备蛋白样品; 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，应用湿转法进行转膜，将蛋白质转移至裁剪好的PVDF膜上，标记好膜的正反面; 5% BSA摇床室温封闭1 h，采用1 × TBST洗膜3次，每次15 min，5% BSA稀释抗体至相应的浓度(1:2 000 DKK1和1:8 000 β-actin)用于一抗杂交，水平摇床4℃过夜。1 × TBST洗涤3次，每次15 min，加入1:2 000的二抗稀释液室温封闭杂交1 h，1×TBST洗涤二抗3次，每次15 min，ECL液暗区显影、曝光。

取对数生长期的SBC-3-DKK1和SBC-3-NC组细胞，调整细胞密度至2 ×10³mL^-1，以每孔100 μL细胞悬液接种至6孔板，补足细胞悬液至2 mL，混匀细胞置于孵箱中常规培养。倒置显微镜下观察，肉眼可见细胞克隆形成时终止培养，弃掉培养液，预冷的PBS轻轻洗涤2 ~ 3次，甲醇固定15 min，弃掉甲醛，结晶紫染液染色20 min，采用流动的自来水轻轻冲洗，置于空气中干燥。肉眼计数可见的克隆数，计算克隆形成率。克隆形成率= (克隆数/接种细胞数) × 100%。实验重复3次。

侵袭实验：Matrigel基质胶包被Transwell小室基底膜，注意避免气泡的产生，室温风干; 常规处理细胞，无血清培养基重悬，密度调整为5 ×10⁴mL^-1，取每孔200 μL在含8 μm孔径膜的Transwell上室沿着孔的边缘向下室中加入500 μL完全培养基。迁移实验：不需要铺基质胶，其余同侵袭实验。常规培养至24 h，取出小室，以预冷的PBS淋洗，采用洁净的棉签擦去微孔膜内层细胞，进行甲醇固定(15 min)和结晶紫染液染色(20 min)，冲洗染色液、室温风干。采用倒置显微镜计数穿过微孔膜的细胞数，随机计数10个视野，取平均值。实验重复3次。

常规裂解2组细胞、提取总蛋白、定量并制备蛋白样品; 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、标记膜、封闭和洗涤，1:2 000 MMP-9和1:8 000 β-actin一抗杂交，水平摇床4℃过夜，洗涤，以1:2 000的二抗稀释液室温封闭杂交1 h，洗涤; ECL液暗区显影、曝光。

采用SPSS 24.0统计软件进行统计学分析。2组SBC-3细胞中DKK1 mRNA表达水平、DKK1蛋白表达水平、克隆形成率、细胞迁移数和细胞侵袭数以x±s表示，组间样本均数比较采用两独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

感染72 h时倒置荧光显微镜下观察慢病毒感染的SBC-3-DKK1细胞和SBC-3-NC细胞，显示绿色荧光率大于80%，提示感染成功。见图 1(插页四)。

图 1 倒置荧光显微镜下观察慢病毒感染SBC-3细胞荧光率(×200) Fig. 1 Fluorescence rate of lentivirus-infected SBC-3 cells observed under inverted fluorescence microscope(×200)

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RT-PCR结果显示：SBC-3-DKK1组细胞中DKK1mRNA表达水平明显高于SBC-3-NC组(P＜0.05)(图 2)。Western blotting法检测结果显示：SBC-3-DKK1组细胞中DKK1蛋白表达量高于SBC-3-NC组(图 3)。

*P < 0.05 vs SBC-3-NC group. 图 2 SBC-3-DKK1和SBC-3-NC组细胞中DDK1 mRNA表达水平 Fig. 2 Expression levels of DKK1 mRNA in cells in SBC-3-DKK1 and SBC-3-NC groups

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Lane 1:SBC-3-NC group; Lane 2:SBC-3-DKK1 group. 图 3 Western blotting法检测SBC-3-DKK1和SBC-3-NC组细胞中DDK1蛋白表达电泳图 Fig. 3 Electrophoregram of expressions of DKK1 protein in cells in SBC-3-DKK1 and SBC-3-NC groups detected by Western blotting method

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SBC-3-DKK1组细胞克隆形成率(31%±2%)高于SBC-3-NC组(14%±1%)，组间比较差异有统计学意义(P=0.002 6)。见图 4(插页四)。

图 4 平板克隆法检测SBC-3-DKK1组(A)和SBC-3-NC组(B)细胞克隆形成率 Fig. 4 Clone formation rate of cells in SBC-3-DKK1 group(A) and SBC-3-NC(B) group detected by plate cloning method

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迁移实验：每高倍视野(×200)下SBC-3-DKK1组穿膜细胞数为131.00±5.67，SBC-3-NC组穿膜细胞数为70.00±2.52，2组穿膜细胞数比较差异有统计学意义(P=0.006 2)。侵袭实验：SBC-3-DKK1组穿膜细胞数为101.00±3.51，SBC-3-NC组穿膜细胞数为57.00 ±3.00，2组穿膜细胞数比较差异有统计学意义(P=0.0214)。见图 5(插页四)。

A, B: Migration; C, D: Invasion; A, C: SBC-3-DKK1 group; B, D: SBC-3-NC group. 图 5 实验检测SBC-3-DKK1组和SBC-3-NC组细胞迁移和侵袭能力(×200) Fig. 5 Migration and invasion abilities of cells in SBC-3-DKK1 group and SBC-3-NC group detected by Transwell assay (×200)

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Western blotting法检测结果显示：与SBC-3-NC组比较，SBC-3-DKK1组SBC-3细胞中MMP-9蛋白表达量明显升高。见图 6。

Lane 1:SBC-3-NC group; Lane 2:SBC-3-DKK1 group. 图 6 Western blotting法检测SBC-3-DKK1和SBC-3-NC组SBC-3细胞中MMP-9蛋白表达电泳图 Fig. 6 Electrophoregram of expressions of MMP-9 protein in SBC-3 cells in SBC-3-DKK1 and SBC-3-NC groups detected by Western blotting method

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DKK1基因是DKK基因家族中的一员，长度为1 815 000 bp，位于10号染色体10q11.2上，其编码的DKK1蛋白相对分子质量约为27 000，属于分泌型糖蛋白，定位于细胞浆内，包含有2个富含半胱氨酸的保守结构域。DKK1可以通过与LRP5/LRP6受体和Kremen-1/2结合成复合物^[4]，诱导快速的细胞内吞，减少细胞膜上的LRP5/LRP6，以此阻断Wnt信号向胞内传递，也可以通过竞争性地与LRP5/LRP6受体结合，特异性地抑制Wnt信号通路，从而在肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移和肿瘤新生血管等过程中发挥重要作用^[5]。DKK1在除胎盘及前列腺以外的正常组织中几乎无表达，但是在非小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌和宫颈癌等多种肿瘤组织中均存在异常高表达^[6-7]，提示DKK1蛋白通过调控Wnt信号通路与多种恶性肿瘤的发生发展有关。但是DKK1蛋白在SCLC发生发展中的作用机制目前仍不明确。

既往的实验^[6]结果显示：SCLC患者血清中DKK1蛋白高表达，因此推测DKK1与SCLC的发生发展具有相关性。本研究选择人SCLC细胞株SBC-3，通过慢病毒转染的方法获得稳定表达的SBC-3-DKK1细胞，上调DKK1蛋白表达可以促进SBC-3细胞的增殖、迁移和侵袭能力，提示DKK1蛋白可以影响SBC-3细胞的生物学功能。这一结论与既往文献^[7]报道的DKK1蛋白在其他恶性肿瘤中的表现一致，初步揭示了DKK1蛋白在SCLC发生发展中的作用。

DKK1蛋白在Wnt信号调控中具有双向作用。作为内源性抑制剂，DKK1蛋白可以对经典的Wnt信号通路进行抑制，同时其也受到Wnt/β-catenin信号通路的负反馈调节^[8]。本研究初步探讨了DKK1蛋白促进SCLC发生发展的机制，发现DKK1蛋白表达上调时，MMP-9蛋白表达水平升高。MMP-9属于基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)家族中的一员，是目前研究最广泛的MMPs之一，在癌细胞侵袭和肿瘤转移中发挥重要作用。人MMP-9基因定位于20号染色体20q13.12^[9]。MMP-9蛋白的催化结构域包括纤连蛋白Ⅱ型(FN2)结构域、活性位点和锌结合区^[10]，是依赖于锌的内肽酶成员之一^[11]。MMP-9蛋白的主要功能是降解细胞外基质和基底膜，而基底膜的破坏是肿瘤发生发展的重要环节，因此MMP-9蛋白在肿瘤的发生发展中起重要的作用^[12]，其在SCLC、乳腺癌及肝癌中均存在过表达^[13-15]。文献^[16]报道：MMP-9蛋白与血管生成拟态(vasculogenic mimicry, VM)具有相关性，属于VM相关蛋白。MANIOTIS等^[17]在1999年首次提出了一种与经典肿瘤血管生成途径不同，不依赖机体内皮细胞的全新肿瘤微循环模式，即VM的概念。随后研究不断发现在肝癌、前列腺癌及卵巢癌等瘤种中均存在VM，VM的存在与肿瘤的生长、分化程度和侵袭性等密切相关。DKK1蛋白与VM及其相关蛋白之间具有明确的相关性^{[16, 18]}。在非小细胞肺癌(NSCLC)的癌组织中DKK1蛋白的表达与VM相关蛋白MMP-9的表达具有一致性，在NSCLC细胞株A549和H460中上调DKK1蛋白表达后，MMP-9蛋白表达随之升高，初步证实DKK1蛋白可能通过上调MMP-9蛋白的表达介导SCLC的发生发展。

综上所述，在SCLC细胞中高表达DKK1蛋白可通过调控VM相关蛋白MMP-9蛋白的表达促进人SCLC的生物学功能，初步揭示了DKK1蛋白在人SCLC发生发展中的作用及其机制，为进一步研究其在人SCLC中的作用机制奠定了实验基础，同时为研究DKK1蛋白相关抑制药物在人SCLC防治中的临床应用提供了理论依据。