肺癌是最常见的恶性肿瘤，也是发病率最高的恶性肿瘤，死亡率居恶性肿瘤死亡率的第一位^[1]。肺癌发病原因较多，吸烟、空气污染、肺部慢性感染和遗传因素等均能引起肺癌的发生^[2]。非小细胞肺癌又称非小细胞癌，属于肺癌的一种，约占肺癌总数的85%^[3], 临床上非小细胞肺癌患者初期的主要症状为咳嗽、胸痛、发热和血痰等，晚期会出现呼气困难、淋巴结肿大、面部或上臂出现肿胀和体质量降低等症状^[4]。早期肺癌一般采取手术的治疗方式，晚期需要进行多学科综合治疗，包括放化疗，但化疗后的一段时期，患者会产生一定的耐药性，因此急需寻找一种新的方法克服耐药性的产生^[5]。CRISPR相关核酸酶9(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated nuclease 9，CRISPR/Cas9)由效率最高的基因编辑技术^[6]将入侵质粒DNA的片段或者入侵噬菌体整合到CRISPR中，对同源序列进行降解，提高免疫性^[7]。CRISPR/Cas9也是最近几年发现的一种基因编码技术，由于其自身具有精确性和高效性，目前已经广泛应用于肿瘤治疗^[8]，这种基因编码技术可以鉴别肿瘤的耐药基因，并且对耐药基因进行敲除可以预防肿瘤对药物的耐药性。小分子酪氨酸激酶(tyrosinekinases, TKs)通过各种底物酶影响下游信号的传导，通过一系列反应影响细胞的增殖、凋亡和迁移等。酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor, TKI)对TKs产生抑制作用，对于转移非小细胞癌通常，采用表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)靶向治疗方式^[9]，其主要特点是具有选择性和可逆性，主要通过TKs催化区域的ATP位点阻断传导信号，从而抑制肿瘤的生长^[10]，但EGFR二次突变会引起吉非替尼耐药，影响肿瘤的治疗^[11]，所以需要对肿瘤的耐药基因进行敲除，以提高治疗效果。本研究主要探讨CRISPR/Cas9介导TKI对非小细胞肺癌基因靶向治疗疗效的影响，提高吉非替尼耐药的敏感性。

非小细胞肺癌细胞株A549(上海生命科学研究院)。phU6-sgRNA骨架质粒、胎牛血清和DMEM培养基(苏州碧云天生物技术有限公司)，Lipofectamine^TM2000转染试剂盒和CCK-8检测试剂盒和miRNA分离试剂盒(上海吉凯基因化学公司)，TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)，无内毒素质粒大提试剂盒(美国Hyclone公司)，碘化丙啶(PI，南京建成生物工程研究所)，BCA蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，MDM2、Bax、Bcl-2和TKI抗体(上海苏彭化学试剂公司)。

在NCBI网站上检索到TKI的基因序列，利用网站(http://crispr.mit.edu)设计3个不同TKI sgRNA序列，sgRNA1上游引物为5′-ACCGCACTACTCTCAAATCTGTTC-3′，sgRNAl下游引物为5′-AAACGAACAGATTTGAGAGTAGTG-3′；sgRNA2上游引物为：5′-ACCGTTTGTCAATTCGTTCTGAAG-3′，sgRNA2下游引物为5′-CAGTCCAGCCCATACTTTTCTTAG-3′; sgRNA3上游引物为5′-ATGGCCTTCCGTGTTCCTACGC CGA-3′, sgRNA3下游引物为5′-CACCTTCTTGATGTCATCATACTG-3′。在每条sgRNA序列的正义链5′端添加AACG, 正义链添加ACAG, 与经BsaⅠ酶切后的phU6-sgRNA骨架质粒形成的黏性末端互补，构建Lenti-Cas9-gRNA-EGFP表达质粒。

将A549细胞株置于6孔培养板中进行培养，采用显微镜观察细胞达到80%~90%的融合状态时，使用转染试剂进行细胞转染，质粒终浓度为1 mg·L^-1, 以相同的空白载体为参照，待细胞转染48 h，提取各组A549细胞基因，严格按照细胞基因试剂盒使用说明标准提取细胞基因。

将Lenti-Cas9-gRNA-EGFP质粒转染到A549细胞株24 h后，将细胞株接种于96孔板中，采用有限稀释法进行操作，待细胞扩增，进行传代和蛋白提取。根据TKI基因序列，合成3个gRNA寡核苷酸序列，分别为gRNAl、gRNA2和gRNA3，并与Lenti-Cas9-gRNA-EGFP质粒重组，将重组后的Lenti-Cas9-gRNA-EGFP质粒混链合成到A549细胞中，根据TKI表达情况分为A549细胞株、A549TKs^-/+细胞株和A459TKs^-/-细胞株，Western blotting法检测细胞中提取蛋白的表达水平。

将A549细胞株置于EP管中，注入2 μL胰酶消化，3 min后终止，不断地吹打细胞，收集液体进行沉淀后，加入200 μL RIPA裂解液，收集上清，13 000 r·min^-1低温离心20 min，加入已经配好的裂解液均匀搅拌，待沉淀后，在冰上裂解10 min。采用BCA检测蛋白浓度，注入金属浴进行蛋白变性处理，-80℃冻存，取10μg蛋白样品，电泳后，转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭1 h，加入配比为1:400的MDM2、Bax、Bcl-2和TKI抗体一抗，4℃孵育过夜，加入配比为1:500山羊抗兔AF555标记二抗，室温孵育60 min，PBS清洗3次，ECL显影，胶片曝光。目标蛋白表达水平＝目标蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值。

取对数生长期A549、A549TKs^-/+和A549TKs^-/-细胞株接种在96孔板中，在24、48和72 h替换原培养基1次，加入CCK-8溶液之前以每孔200μL不含药物的无血清培养基取代原培养液，再加入浓度为5 g/L的CCK-8溶液20μL，孵育4 h。酶标仪参数设置为450 nm，检测各孔的吸光度(A)值，以A值代表细胞活性。

取对数生长期的3种细胞株接种于6孔板中, 采用200μL黄枪头的枪尖在6孔板中间位置划出1条贯穿培养孔的划痕, 各孔的划痕要一致, 弃去培养液, PBS漂洗3次, 培养48 h, 弃去悬浮细胞株, 对各孔进行拍照, 观察划痕附近的细胞迁移情况。细胞划痕愈合率＝愈合面积/划痕面积×100%。

取3种细胞株, 采用0.25%胰酶消化, 接种于6孔培养板中, 置入37℃、CO₂培养箱中培养, 24 h后收集细胞, 调整细胞浓度, PBS洗涤3次, 离心处理, 4℃、3 000 r·min^-1离心10 min, 弃去上清。加入5μL Annexin Ⅴ-FITC, 摇匀, 避光孵育5 min, 2 h后检测细胞凋亡率，采用计算机WinMDI软件计算细胞凋亡率。

取对数生长期的3种细胞株，采用0.25%胰酶消化并计数，将细胞株接种于培养皿中，放在培养箱培养2周，培养皿中能看见细胞株增多时，丢弃原培养液，PBS漂洗3次, 加入1 mL的3%多聚甲醛固定20 min，弃去固定液，加入甲紫染色60 min，洗去染色液，拍照并记录克隆细胞株数，计算集落生成率。集落生成率＝集落形成数/接种细胞数×100%。

取对数生长期的3种细胞株, 采用0.25%胰酶消化, 接种于96孔培养板中, 细胞壁增厚，更换培养基原液，并加入6 mmol·L^-1吉非替尼，置于培养箱中恒温下培养，24、48和72 h时替换原培养基1次，培养120 min，按照上述方法检测吉非替尼干预后细胞活性、细胞凋亡率、细胞迁移能力、细胞中蛋白表达水平和细胞集落生成率。

采用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析。A549、A549TKs^-/+和A549TKs^-/-细胞活性、细胞凋亡率、细胞迁移能力、细胞集落生成率、细胞中蛋白表达水平以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

与原始A549细胞株比较，A549TKs^-/+细胞株中TKI蛋白表达水平较低，A549TKs^-/-细胞株中无TKI蛋白表达。经测序，插入序列与预期相符，无碱基突变，证明敲除质粒构建成功。见图 1和2(插页四)。

Lane 1: Normal A549 cell strain; Lane 2: A1 cell strain; Lane 3: A2 cell strain; Lane 4: A3 cell strain; Lane 5: A4 cell strain. 图 1 Western blotting法检测A549细胞株中TKs蛋白表达电泳图 Fig. 1 Electrophoregram of expression of TKs protein in A549 cell strains detected by Western blotting method

图选项

图 2 DNA测序图谱 Fig. 2 DNA sequencing map

图选项

A549、A549TKs^-/+和A549TKs^-/-细胞活性分别为1.127±0.594、1.019±0.627和1.292±0.686，细胞活性比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图 3。细胞凋亡率检测结果显示：敲除TKI基因后，A549、A549TKs^-/+和A549TKs^-/-细胞凋亡率为(8.237±3.581)%、(7.918±3.074)%和(7.193±2.981)%，细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图 4。细胞划痕实验结果显示：A549、A549TKs^-/+和A549TKs^-/-细胞迁移能力无差异, 见图 5(插页四)。

图 3 CCK-8法检测细胞株活性 Fig. 3 Activities of cell strains detected by CCK-8 method

图选项

A: A549 cell strain; B: A549TKs-/+ cell strain; C: A549TKs-/- cell strain. 图 4 流式细胞术检测细胞凋亡率 Fig. 4 Apoptotic rates of cells detected by flow cytometry

图选项

A: A549 cell strain; B: A549TKs-/+ cell strain; C: A549TKs-/-cell strain. 图 5 细胞划痕实验检测各组细胞迁移能力 Fig. 5 Migration abilities of cells in various groups detected by cell scratch test

图选项

6 mol·L^-1吉非替尼干预72 h后，A549、A549TKs^-/+和A549TKs^-/-细胞活性分别为1.278±0.912、1.031±0.527和0.892±0.364；与A549细胞比较，A549TKs^-/+和A549TKs^-/-细胞的细胞活性降低(P < 0.05), 见图 6。细胞凋亡率检测结果显示：A549、A549TKs^-/+和A549TKs^-/-细胞凋亡率分别为(14.782±8.923)%、(21.864±11.325)%和(32.132±14.981)%；与A549细胞株比较，A549TKs^-/+和A549TKs^-/-细胞株的细胞凋亡率升高(P < 0.05), 见图 7。A549、A549TKs^-/+和A549TKs^-/-细胞株细胞划痕愈合率为(23.581±0.238)%、(34.147±1.674)%和(48.734±3.562)%，即细胞迁移能力明显降低。见图 8(插页四)。

图 6 CCK-8法检测吉非替尼干预后细胞活性 Fig. 6 Activities of cells after gefitinib intervention detected by CCK-8 method

图选项

A: A549 cell strain; B: A549TKs-/+ cell strain; C: A549TKs-/- cell strain. 图 7 吉非替尼干预后流式细胞术检测各组细胞凋亡率 Fig. 7 Apoptotic rates of cells after gefitinib intervention detected by flow cytometry

图选项

A: A549 cell strain; B: A549TKs-/+cell strain; C: A549TKs-/- cell strain. 图 8 吉非替尼干预后细胞划痕实验检测各组细胞株迁移能力 Fig. 8 Migration abilities of cell strains in various groups detected by cell scratch test after gefitinib intervention

图选项

A549、A549TKs^-/+和A549TKs^-/-细胞株中P53蛋白表达水平分别为0.628± 0.256、1.432±0.573、1.892±0.634；与A549细胞株比较，A549TKs^-/+和A549TKs^-/-细胞株中P53蛋白表达水平明显升高(P < 0.05)。A549、A549TKs^-/+和A549TKs^-/-细胞株中MDM2蛋白表达水平分别为3.019±1.264、0.937± 0.473、0.515±0.234；与A549细胞株比较，A549TKs^-/+和A549TKs^-/-细胞株中MDM2蛋白表达水平明显降低(P < 0.05)。A549、A549TKs^-/+和A549TKs^-/-细胞株中Bcl-2蛋白表达水平分别为2.875±1.073、1.332±0.398和0.617±0.295；与A549细胞株比较，A549TKs^-/+和A549TKs^-/-细胞株中Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P < 0.05)。A549、A549TKs^-/+和A549TKs^-/-细胞株中Bax表达水平分别为0.314±0.175、1.278±0.362和1.479± 0.416；与A549细胞株比较，A549TKs^-/+和A549TKs^-/-细胞株中Bax蛋白表达水平明显升高(P < 0.05)。见图 9。

Lane 1: A549 cell strain; Lane 2:A549TKs-/+ cell strain; Lane 3:A549TKs-/- cell strain. 图 9 Western blotting法检测细胞株中P53、MDM2、Bcl-2和Bax蛋白表达电泳图 Fig. 9 Electrophoregram of expressions of P53, MDM2, Bcl-2, and Bax proteins in cell strains detected by Western blotting method

图选项

吉非替尼作用72 h后，A549、A549TKs^-/+和A549TKs^-/-细胞株的细胞集落生成率分别为(38.214±3.175)%、(21.361±2.163)%和(14.526±1.267)%，A549TKs^-/+和A549TKs^-/-细胞株的细胞集落生成率明显低于A549细胞株(P < 0.05)。见图 10。

A: A549 cell strain; B: A549TKs-/+ cell strain; C: A549TKs-/- cell strain. 图 10 吉非替尼干预后细胞集落形成能力 Fig. 10 Colony formation abilities of cells after gefitinib intervention

图选项

肺癌是一种发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，而且预后比较差，主要原因为肺癌细胞发生了转移和入侵^[12]，EGFR是TKs受体，是非小细胞肺癌的主要驱动因素，参与了细胞增殖、迁移和凋亡^[13]。近年来，分子靶向EGFR药物的出现提高了非小细胞肺癌的治疗效果^[14]，吉非替尼属于一种小分子TKI^[15]，在非小细胞肺癌治疗方面取得了明显的进展，但治疗6~8个月后，患者会出现吉非替尼的耐药性，因此需要研究新的治疗手段克服肺癌的耐药性。MDM2是一种癌症基因，能导致p53失去对肿瘤的抑制能力，所以阻断p53和MDM2的相互作用^[16]现已成为治疗非小细胞肺癌的主要方法之一，采用CRISPR/Cas9靶向技术可以验证Nutlin活性，Nutlin可以阻碍p53与MDM2相互结合，具体方法为利用CRISPR/Cas9技术设计不同sgRNA，建立非小细胞肺癌细胞对EGFR抑制剂耐药的模型，敲除A549细胞株中的TKs基因，评估用药效果^[17-18]。

本实验结果显示：经6 mmol·L^-1吉非替尼干预后，与A549细胞株比较，A549TKs^-/+和A549TKs^-/-细胞株的细胞活性明显受到抑制，细胞凋亡率明显升高，细胞划痕愈合率明显降低，细胞迁移能力明显降低。经吉非替尼干扰后细胞活性和迁移能力降低、细胞凋亡率升高，说明敲除TKI基因的A549细胞株对吉非替尼的药物敏感性明显升高。PAZ-ARES等^[17]采用CRISPR/Cas9基因编码技术对结肠癌SW1116细胞系敲除IL-6基因，提高了其对顺铂耐药的敏感性。

CRISPR/Cas9技术操作简单，而且能够精确敲除基因，目前在乳腺癌、结肠癌、白血病和黑素瘤等的耐药中广泛应用，能够快速建模，对体内体外细胞进行快速编辑，精确设计sgRNA，为克服肿瘤的耐药性提供更多可能。TKs的受体和配体与许多肿瘤关系密切，较多癌症中会出现TKs蛋白过表达，导致癌细胞增殖和存活^[18]，所以需要对TKI进行抑制，降低TKs水平，增加治疗药物的敏感性。本研究结果显示：与A549细胞株比较，另外2种细胞株中P53和Bax蛋白表达水平明显降低，MDM2和Bcl-2明显升高。吉非替尼作用72 h后，基因敲除细胞株抑制菌落的生成能力明显强于A549细胞株，说明TKI不表达或者表达较低的情况下，非小细胞肺癌细胞对吉非替尼的敏感性增加。有研究^[19]表明：利用CRISPR/Cas9系建立MET敲除的HEK293细胞，MET蛋白表达水平会更高，活性更强，对MET抑制剂的敏感性也更强。SCHULER等^[20]研究表明：CRISPR/Cas9系统构建对顺铂(CDDP)敏感，敲除白细胞介素6(interleukin 6, IL-6)的SW1116细胞系为IL-6介导的结肠癌化疗耐药提供了可靠基础。

综上所述，利用CRISPR/Cas9系统建立TKs敲除A549细胞系，经过吉非替尼的干预，细胞活性明显降低，细胞凋亡率升高，细胞迁移能力明显增强，说明敲除TKs的A549细胞系对吉非替尼的药物敏感性升高，本研究为探索TKI介导的非小细胞肺癌化疗耐药机制提供了可靠依据。