2019, Vol. 45扩展功能
文章信息
- 张恒, 郭彬, 田浩, 李兰, 吴静, 门秀丽
- ZHANG Heng, GUO Bin, TIAN Hao, LI Lan, WU Jing, MEN Xiuli
- 氯化锂对地塞米松诱导的大鼠胰岛β细胞凋亡的影响及其机制
- Effect of lithium chloride on apoptosis of islet β cells in rats induced by dexamethasone and its mechanism
- 吉林大学学报(医学版), 2019, 45(06): 1231-1237
- Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2019, 45(06): 1231-1237
- 10.13481/j.1671-587x.20190607
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文章历史
- 收稿日期: 2019-01-10
生理剂量糖皮质激素在体内广泛存在，并且在调节细胞生长发育、机体糖盐代谢平衡和应激反应等多方面起重要作用。超生理剂量的糖皮质激素有抗炎、抗休克和免疫抑制的作用[1]，因此被临床广泛应用于各种炎症和免疫性疾病的治疗[2-3]，但是长时间、大剂量使用糖皮质激素会增加一些患者发生糖尿病的风险[4-5]，其发病率为10%~20%[6]。近年来糖尿病发病率的逐年升高引起了人们的广泛关注。但是目前临床上除停药外尚无其他有效治疗手段[7]。有研究[8-9]表明：胰岛β细胞可表达糖皮质激素受体，糖皮质激素可以直接诱导胰岛β细胞发生凋亡，这可能是导致胰岛素分泌降低的主要原因，这种细胞凋亡不会被停用糖皮质激素所逆转。另有研究[10-11]显示：糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)在激素诱导人骨肉瘤细胞和神经元凋亡过程中发挥关键作用。GSK-3β是一种多功能丝/苏氨酸激酶，是多种信号通路的关键调节因子，参与多种细胞功能例如糖原合成、细胞周期调节和增殖。GSK-3β在细胞静息时是激活的，Ser9磷酸化使GSK-3β活性受到抑制，但有关GSK-3β在激素诱导胰岛β细胞凋亡过程中作用的报道较少。氯化锂(LiCl)是一种情绪稳定剂[12]，可选择性抑制GSK-3β[13-14]。近年来越来越多的实验[15-16]证明锂离子具有抗氧化应激和抗缺血缺氧的作用，但其对地塞米松(dexamethasone, Dex)诱导胰岛β细胞凋亡的影响鲜见报道。本实验建立Dex诱导的胰岛β细胞凋亡模型，观察GSK-3β在激素诱导胰岛β细胞凋亡中的作用，并初步探讨GSK-3β活性与氧化应激的关系，为临床防治类固醇性糖尿病提供新的实验依据。
1 材料与方法 1.1 细胞、主要试剂和仪器大鼠胰岛细胞瘤INS-1细胞系由北京中日友好医院病理生理学实验室惠赠。细胞超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、NADPH氧化酶4(Nox4)、NADPH oxidase(又称p47phox)、GSK-3β和LiCl试剂(美国Sigma公司)，RPMI-1640(美国Gibco公司)，逆转录试剂盒(美国Promega公司)，BCA蛋白测定试剂盒(中国北京碧云天生物公司)，RNA提取试剂盒(美国Qiagen公司)，活性氧(ROS)检测试剂盒(美国Genmed公司)，Annexin Ⅴ/PI检测试剂盒(美国Becton Dickinson公司)，TUNEL试剂盒(瑞士Roche公司)，兔抗GSK-3β多克隆抗体和兔抗p-GSK3β(ser9)多克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司)，兔抗iNOS多克隆抗体和兔抗Nox4单克隆抗体(英国Abcam公司)，抗线粒体超氧化物岐化酶抗体(美国Upstate公司)。CO2培养箱(美国Thermo公司)，离心机(日本Kubota公司)，7500Real-timePCR仪(美国Bio-Rad公司), 酶标仪Athnos2010(澳大利亚Salzburg公司)，蛋白垂直电泳仪、蛋白电泳转膜仪和SDS-PAGE电泳槽(美国Bio-Rad公司)，凝胶成像系统(美国Innotech公司)。
1.2 GSK-3β抑制剂LiCl的配制和细胞分组首先配制2种条件培养基：一是将10 mmol·L-1LiCl加入含有0.1 μmol·L-1Dex的药物培养基中，配制成10 mmol·L-1 LiCl+0.1 μmol·L-1Dex培养基；二是将10 mmol·L-1 LiCl加入含有3%FCS的完全培养基中，配制成单纯LiCl培养基。当INS-1细胞达到60%融合时，加入配制好的单纯LiCl培养基放入孵箱进行预处理30 min，之后弃掉单纯LiCl培养基，加入10 mmol·L-1 LiCl+0.1 μmol·L-1 Dex的培养基即为LiCl+0.1μmol·-1Dex组；不用单纯LiCl培养基预处理，直接换成含0.1 μmol·L-1Dex的培养基即为0.1 μmol·L-1Dex组；对照组仅以含3%FCS的培养基培养，作用48 h后于规定时间检测各组细胞的各项指标。
1.3 TUNEL法检测各组INS-1细胞凋亡率TUNEL试剂盒检测各组细胞凋亡情况。INS-1细胞接种于96孔板中，每孔加入量为150 μL，细胞数约为2×104个，每组设5个平行孔，实验重复3次。阳性对照：向孔细胞通透加入DNase Ⅰ混合液(3 000U·mL-1 DNase Ⅰ，50 mmol·L-1 Tris-HCl，pH＝7.5，10 mmol·L-1 MgCl2，1 g·L-1BSA)，室温下孵育10 min。阴性对照：仅加入标记液。最后以PBS清洗3次，倒置显微镜下观测细胞着色情况并拍照储存，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。
1.4 Annexin Ⅴ/PI染色流式细胞术检测各组INS-1细胞凋亡率将INS-1细胞接种于6孔板中，每孔加入量为150 μL，细胞数约为3.8×105个。培养24 h待细胞贴壁存活后，分别使用相应培养基培养48 h后，收集细胞，按照试剂盒说明进行Annexin Ⅴ-PI双染，经C6流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。
1.5 Real-time PCR法检测各组INS-1细胞中SOD、iNOS、Nox4和p47phoxmRNA表达水平将INS-1细胞接种于6孔板中，每孔细胞数约为3.8×105个。培养24 h待细胞贴壁后换成相应的条件培养基收集细胞，按照试剂盒提取细胞总RNA，测定核酸浓度后按照Promega逆转录试剂盒说明进行操作，将提取的总RNA逆转录为cDNA。反应条件：逆转录反应(42℃、60min)，灭活酶活性(95℃、5 min)，之后进行Real-time PCR。95℃预变性1 min，94℃、15 s，60℃、30 s，72℃、30 s，40个循环。反应结束后，确认Real-time PCR的扩增曲线和熔解曲线，以2-ΔCt方法计算SOD、iNOS、Nox4和p47phoxmRNA表达水平。PCR反应的引物序列和产物长度见表 1。
| Amplified fragment | Primer sequence | Length of product(bp) |
| β-actin | Upstream：5′-GACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3′ Downstream：5′-ATAGAGCCACCAATCCACACAGAG-3′ |
173 |
| GSK-3β | Upstream：5′-CACCTCTGGCTACCATCCTTAT-3′ downstream：5′-ATTATTGGTCTGTCCACGGTCT-3′ |
119 |
| iNOS | Upstream：5′-GTCTGGCGAAGAACAATCC-3′ Downstream：5′-TCCCGAAACGCTACACTT-3′ |
314 |
| Nox4 | Upstream：5′-TAGCTGCCCACTTGGTGAACG-3′ Downstream：5′-TGTAACCATGAGGAACAATACCACC-3′ |
245 |
| NADPH oxidase(p47phox) | Upstream：5′-ATAATGTAGCTGACATCATG-3′ Downstream：5′-ATGCTCTGTGCATTGCGGAT-3′ |
495 |
| SOD | Upstream：5′-CGACCTTGCTCCTTATTG-3′ Downstream：5′-TGACCTGCCTTACGACTA-3′ |
387 |
将INS-1细胞接种于T25的培养瓶中，每瓶细胞数约为5×105个。培养24 h，待细胞贴壁后换成相应的条件培养基，继续培养48 h后收集细胞，加入蛋白裂解液，提取蛋白，采用蛋白定量试剂盒测定总蛋白浓度(BCA法)。取60 μg细胞总蛋白，于100 ℃水浴3 min，上样进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，湿转移法将蛋白条带转移至PVDF膜上(Millipore)，50 g·L-1脱脂奶粉封闭后，分别加入GSK-3β、p-GSK-3β、SOD、iNOS、Nox4和p47phox一抗(美国Cell Signaling Technology公司) (1:300)和β-actin一抗(美国Sigma公司) (1:1 000)置于4 ℃冰箱振荡孵育过夜。TBST洗膜后，加入HRP标记的二抗(1: 20 000)室温反应1 h。TBST洗涤后，ECL化学发光试剂于暗室中显影，X线胶片曝光，拍照。采用Gel Image Syste4.2软件测量各条带面积和灰度值。以β-actin为内参，以GSK-3β、p-GSK-3β、SOD、iNOS、Nox4和p47phox蛋白条带灰度值与β-actin条带灰度值之比表示目的蛋白表达水平。
1.7 各组INS-1细胞中ROS水平检测将INS-1细胞接种于96孔板中，每孔加入量为150 μL，细胞数约为2×104个。培养24 h，待细胞贴壁后换成相应的条件培养基，继续培养48 h，通过GENMED试剂盒检测细胞中ROS水平。使用荧光酶标仪进行定量检测，激发波长为485 nm，发射波长为538 nm。相对荧光单位(relative fluorescence unit, RFU)增高表明ROS水平升高。
1.8 各组INS-1细胞中NO水平的检测采用Griess法检测加入LiCl前后细胞中NO水平，将INS-1细胞接种于24孔板中，调整细胞密度为1.2×106mL-1，培养24 h，待细胞贴壁后换成相应的条件培养基，继续培养48 h，收集细胞培养上清液，在酶标仪540 nm处检测吸光度(A)值，以NaNO2值作为标准曲线，按照试剂盒说明书检测细胞中NO水平。
1.9 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。各组INS-1细胞中ROS水平，NO水平，细胞凋亡率，细胞中SOD、iNOS、Nox4、p47phox和GSK3βmRNA表达水平, 细胞中GSK-3β、p-GSK-3β、SOD、iNOS和Nox4蛋白表达水平以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间均数两两比较采用t检验。以α=0.05为检验水准。
2 结果 2.1 各组INS-1细胞凋亡率TUNEL染色结果和AnnexinⅤ-PI染色流式细胞术检测结果均显示：与对照组比较，0.1 μmol·L-1Dex组INS-1细胞凋亡率升高(P < 0.05)；与0.1 μmol·L-1Dex组比较，LiCl+0.1 μmol·L-1 Dex组INS-1细胞凋亡率降低(P < 0.05)。TUNEL染色结果见图 1(插页二)，细胞凋亡率检测结果见图 2和3。
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| A:Control group B:0.1 μmol·L-1 Dex group C:LiCl+0.1 μmol·L-1 Dex group. 图 1 各组INS-1细胞凋亡形态表现(TUNEL，×400) Fig. 1 Apoptotic morphology of INS-1 cells in various groups (TUNEL, ×400) |
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| 1:Control group; 2:0.1μmol·L-1Dex group; 3:LiCl+0.1μmol·L-1Dex group; *P < 0.05 vs control group; △ P < 0.05 vs 0.1 μmol·L-1 Dex group. 图 2 各组INS-1细胞凋亡率 Fig. 2 Apoptotic rates of INS-1 cells in various groups |
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| A:Control group; B:0.1μmol·L-1Dex group; C:LiCl+0.1μmol·L-1 Dex group. 图 3 流式细胞术检测各组INS-1细胞的凋亡率 Fig. 3 Apoptotic rates of INS-1 cells in various groups detected by flow cytometry |
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与0.1μmol·L-1Dex组比较，LiCl+0.1 μmol·L-1 Dex组INS-1细胞中iNOS、Nox4和p47phox mRNA表达水平降低(P＜0.05或P＜0.01)，SOD mRNA表达水平升高(P＜0.05)。见表 2。
| (n=5, x±s) | |||||||||||||||||||||||||||||
| Group | SOD | iNOS | Nox4 | p47phox | |||||||||||||||||||||||||
| Control | 1 | 1 | 1 | 1 | |||||||||||||||||||||||||
| 0.1 μmol·L-1 Dex | 0.40±0.14 | 4.98±0.44 | 2.86±0.43 | 2.58±0.48 | |||||||||||||||||||||||||
| LiCl+0.1 μmol·L-1 Dex | 1.07±0.12* | 1.72±0.33** | 1.49±0.29* | 1.21±0.21** | |||||||||||||||||||||||||
| * P＜0.05 ** P＜0.01 vs 0.1 μmol·L-1Dex group. | |||||||||||||||||||||||||||||
Western blotting法检测结果显示：与对照组比较，0.1 μmol·L-1Dex组INS-1细胞中GSK-3β蛋白表达水平升高；LiCl+0.1μmol·L-1 Dex组INS-1细胞中GSK-3β蛋白表达水平低于0.1 μmol·L-1Dex组(P < 0.05)；与对照组比较，0.1 μmol·L-1Dex组INS-1细胞中p-GSK-3β蛋白表达水平降低，但差异无统计学意义P>0.05)；LiCl+0.1μmol·L-1 Dex组INS-1细胞中p-GSK-3β蛋白表达水平高于0.1 μmol·L-1Dex组(P < 0.05)。见图 4。
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| Lane 1:Control group; Lane 2:0.1μmol·L-1Dex group; Lane 3:LiCl+0.1μmol·L-1Dex group.1:Control group; 2:0.1μmol·L-1Dex group; 3: LiCl+0.1μmol·L-1Dex group; n=5, *P < 0.05 vs 0.1 μmol·L-1Dex group. 图 4 各组INS-1细胞中GSK-3β和p-GSK-3β蛋白表达电泳图(A)和直条图(B，C) Fig. 4 Electrophoregram(A) and histogram(B, C) of expressions of GSK-3β and p-GSK-3β proteins in INS-1 cells in various groups |
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与对照组比较，0.1 μmol·L-1Dex组INS-1细胞中SOD蛋白表达水平降低(P < 0.05)，iNOS和Nox4蛋白表达水平升高(P < 0.05)；与0.1 μmol·L-1Dex组比较，LiCl+0.1 μmol·L-1 Dex组INS-1细胞中SOD蛋白表达水平升高(P < 0.05)，iNOS和Nox4蛋白表达水平明显降低(P < 0.05或P < 0.01)。见图 5。
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| Lane 1:Control group; Lane 2:0.1 μmol·L-1Dex group; Lane 3:LiCl+0.1 μmol·L-1Dex group.*P < 0.05 vs control group; △ P < 0.05, △△ P < 0.01 vs 0.1 μmol·L-1Dex group(n=5). 图 5 各组INS-1细胞中SOD、iNOS和Nox4蛋白表达电泳图(A)和直条图(B) Fig. 5 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of SOD, iNOS and Nox4 proteins in INS-1 cells in various groups |
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与0.1μmol·L-1 Dex组比较，24 h后LiCl+0.1 μmol·L-1 Dex组INS-1细胞中ROS水平明显降低(P＜0.05)。见图 6。
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| 1:Control group; 2:0.1μmol·L-1Dex group; 3:LiCl+0.1μmol·L-1Dex group; *P < 0.05 vs control group; △P < 0.05 vs 0.1 μmol·L-1Dex group(n=5). 图 6 各组INS-1细胞中ROS水平 Fig. 6 ROS levels in INS-1 cells in various groups |
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与0.1 μmol·L-1 Dex组比较，48 h后LiCl+ 0.1μmol·L-1Dex组INS-1细胞中NO水平明显降低(P＜0.05)。见图 7。
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| 1:Control group; 2:0.1μmol·L-1Dex group; 3: LiCl+0.1μmol·L-1Dex group; *P < 0.05 vs control group; △P < 0.05 vs 0.1 μmol·L-1 Dex group (n=5). 图 7 各组INS-1细胞中NO水平 Fig. 7 NO levels in INS-1 cells in various groups |
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GSK-3β是一种多功能丝氨酸/苏氨酸激酶，可参与细胞凋亡和增殖及糖原的合成等过程。有学者[17]发现糖尿病患者和动物模型中GSK-3水平明显升高，随后的小鼠胰岛素抵抗模型[14]中也证实敲除GSK-3β或使用GSK-3β抑制剂可以保护胰岛β细胞，预防糖尿病的发生[14]。LiCl是一种情绪稳定剂。早在1996年研究者就提出了LiCl可以选择性抑制GSK-3β。锂可以通过增加GSK-3β丝氨酸抑制性位点的磷酸化、降低GSK-3β Tyr-216位点的磷酸化抑制其活性[18]。但关于LiCl对Dex诱导的胰岛β细胞凋亡影响的报道较少。
本研究在Dex诱导的INS-1细胞凋亡过程中，将LiCl加入到含有Dex的培养基中，配制成LiCl-Dex混合培养基，观察胰岛β细胞凋亡情况。结果显示：LiCl+0.1μmol·L-1Dex组相对于0.1μmol·L-1Dex组细胞凋亡率明显降低，说明LiCl可抑制Dex诱导的INS-1细胞凋亡, 为了进一步验证GSK-3β在此凋亡中的作用，本课题组从基因和蛋白水平分别检测了LiCl加入前后细胞中GSK-3β表达的变化，结果显示LiCl可在一定程度上提高Dex诱导的GSK-3β磷酸化程度，从而抑制GSK-3β的活性。这与GOMEZ-SINTES等[19]在体内和体外实验中发现其抗凋亡的结论相一致, 说明LiCl可通过抑制GSK-3β的活性，在一定程度上减轻Dex诱导的胰岛β细胞凋亡。
研究[20-22]表明:糖尿病者胰岛β细胞功能性衰竭与氧化应激密切相关。采用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)作用于db/db小鼠胰腺β细胞，结果发现抗氧化剂治疗组小鼠胰岛凋亡细胞数明显减少[23]。可见氧化应激在胰岛β细胞凋亡中起到重要作用。本研究结果显示：氧化应激参与Dex诱导的胰岛β细胞凋亡，Dex诱导后INS-1细胞中iNOS表达水平上调使NO产生增加；并且该细胞促ROS生成的Nox4和p47phox水平升高，抗氧化酶SOD水平减少，提示Dex可使INS-1细胞的氧化应激反应增强，说明Dex诱导胰岛β细胞凋亡可能与GSK-3β活性升高和氧化应激反应增强有关。本研究观察了GSK-3β活性抑制剂LiCl对Dex诱导的INS-1细胞氧化应激的影响，结果显示：LiCl+0.1μmol·L-1Dex组INS-1细胞中SOD mRNA表达水平上调，Nox4，p47phox和iNOS mRNA表达水平下调，ROS和NO产生减少，进一步提示抑制GSK-3β活性可减少胰岛β细胞凋亡，且该机制与降低氧化应激反应有关。
综上所述，LiCl可通过促进GSK-3β磷酸化抑制GSK-3β的活性，在一定程度上使Dex诱导的胰岛β细胞凋亡减少，其机制可能与减轻氧化应激反应有关，但确切机制有待于进一步探讨。
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