2019, Vol. 45扩展功能
文章信息
- 华进, 程志彬, 林春霖, 戴起宝, 朱广伟
- HUA Jin, CHENG Zhibin, LIN Chunlin, DAI Qibao, ZHU Guangwei
- 一种高效稳定的磷酸钙转染293T细胞方法的建立及评价
- Establishment and evaluation of a highly efficient and stable calcium phosphate transfection method for 293T cells
- 吉林大学学报(医学版), 2019, 45(05): 1177-1181
- Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2019, 45(05): 1177-1181
- 10.13481/j.1671-587x.20190535
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文章历史
- 收稿日期: 2019-01-19
2. 福建医科大学消化道恶性肿瘤教育部重点实验室, 福建 福州 350005
2. Key Laboratory of Gastrointestinal Cancer, Ministry of Education, Fujian Medical University, Fuzhou 350005 China
目前，将质粒DNA导入动物细胞的方法有很多，最常用的方法包括脂质体转染、电转法、显微注射法和磷酸钙共沉淀法等[1]。虽然脂质体转染方法已经普遍使用，且具有性质稳定和转染效率高等优点，但是价格较为昂贵；而磷酸钙转染的方法使用成本较低，对具体体系加以优化后，能够达到较好的转染效率，特别是对于293T细胞来说，与脂质体的转染效率无明显差异[2]。随着慢病毒感染技术的进一步发展，各种分子生物学技术及基因技术的改进，生命科学研究领域越来越多地应用到慢病毒包装技术，因此，建立起经济高效的293T细胞的转染方法至关重要。1973年，GRAHAM等[3]首次报道磷酸钙转染法。经过科学家的改进，磷酸钙转染法适用于大部分真核细胞DNA的转染，是一种高效经济且对细胞毒性小的真核细胞转染方法[4]，其利用细胞的内吞作用将附着于细胞表面的磷酸钙-DNA沉淀复合物颗粒吸收到细胞内部，进而转染到细胞内部的DNA质粒等可以稳定地表达[5-7]；但在实际应用过程中磷酸钙转染法会因转染条件、操作、细胞种类、试剂配置掌握和转染程序不同等会影响其转染效率[8-10]。由于脂质体转染试剂的应用使DNA质粒等转染细胞的效率明显提高[11-12]，但其缺点是试剂昂贵。293T细胞是由人源肾上皮细胞系衍生所得，其作为工具细胞，具有生长繁殖速度快，营养要求低，可进行体外大规模培养的特点。随着现代分子生物学和病毒技术的发展，实验需要大量具有转染DNA质粒的293T细胞，以获得进一步研究的工具[13-15]，因此高效的293T细胞的磷酸钙转染方法的建立具有重要的实际应用意义。本研究通过改良磷酸钙转染法(实验法)与传统磷酸钙转染法(传统法)从293T细胞的接种密度、质粒DNA的情况以及转染的方法进行研究，确定最佳的转染条件，建立一种高效、稳定的DNA磷酸钙转染方法。
1 材料与方法 1.1 载体、细胞、主要试剂和仪器反转录病毒表达载体pCDH-GFP-3xflag-TRAF6由本实验室构建保存；人胚肾细胞293T由福建医科大学消化道肿瘤重点实验室提供；DMEM、RPMI 1640、Opti-MEM培养基和胎牛血清(美国Gibco公司)，NaCl[上海国药(集团)化学试剂有限公司]，葡萄糖和KCl2[中国医药(集团)上海化学试剂公司]，CaCl2·2H2O和Na2HPO4·12H2O[生物工程(上海)股份有限公司]，HEPES(台湾VWR公司)，单抗兔抗flag单克隆抗体(1:1000, 中国BOSIS公司)，单抗小鼠抗β-actin(1:2000，美国Cell Signaling公司)。凝胶成像系统购于英国Syngene公司，无菌洁净工作台购于苏州净化设备有限公司，SHP-150型生化培养箱购于上海精宏实验设备有限公司，ZEISS Axiocam512倒置荧光显微镜购于德国Leica Microsystems公司。
1.2 细胞培养用DMEM培养基，并添加10%胎牛血清，在37℃、5%CO2培养箱中培养293T细胞。转染前1 d 293T细胞传代，重新种板，转染前细胞汇合度为40%~60%。
1.3 质粒来源和转染效率的计算本课题组构建了pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒，由于质粒能够编码GFP蛋白，该蛋白在荧光显微镜下能够被激发出绿色荧光，可以作为比较转染效率的计数标志。荧光显微镜下观察转染24和48 h后293T细胞编码绿色荧光蛋白的细胞数目，计算其占相同视野下总的293T细胞数目的百分率，即为转染效率。
1.4 传统磷酸钙转染法转染293T细胞转染前1 h换新鲜无血清培养基，在5 mL的圆底试管底部加入25 μL摩尔浓度为2.5 mmol·L-1 CaCl2水溶液和2 μg pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒，加入无菌水至220 μL，小心混匀，且在剧烈吹打下加入220 μL HEPES缓冲液；圆底试管垂直放在混旋器上混旋10 s，室温静置30 min；逐滴加入293T细胞，轻轻晃动混匀；8~12 h换含血清培养基，转染24和48 h后荧光显微镜下观察绿色荧光。相同方法处理pCDH-GFP-vector质粒。
1.5 改良磷酸钙转染法转染293T细胞染前1 h 293T细胞更换37℃预热的无血清培养基，在1.5 mL EP管中加入220 μL无菌水；在水中央加入2 μg pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒；25 μL摩尔浓度为2.5mmol·L-1的CaCl2水溶液小心地加到EP管的底部，沿管壁小心逐滴加入250 μL HEPES缓冲液至液面；在CaCl2与上层溶液之间形成的分层处，用200 μL移液枪轻柔吹打，扰乱分界；室温放置30 min；逐滴加入293T细胞，轻轻晃动混匀；8~12 h换含血清培养基，24和48 h后荧光显微镜下观察绿色荧光。相同方法处理pCDH-GFP-vector质粒。
1.6 细胞转染效率的检测在相同的培养条件下，本实验独立重复3次，每次分别用上述2种方法进行实验；应用荧光倒置显微镜观察绿色荧光，确定转染效率；转染24和48 h后，在200倍视野下任取3个不重复视野，计算编码绿色荧光蛋白的细胞占相同视野中总的293T细胞数目的百分率即为转染效率。
1.7 Real-time PCR法检测293T细胞中肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6) mRNA表达水平pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒转染293T细胞24和48 h后分别提取RNA，逆转录得到cDNA，各取逆转录得到的cDNA模板2.5μL, 在96微孔板上进行PCR反应，每孔取3个复孔对照，取平均值。应用ABI StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems)仪器进行操作，试剂采用SYBR Premix Ex Taq Kit (日本TaKaRa公司)试剂盒。引物均委托福州铂尚生物技术有限公司合成。TRAF6引物：上游引物5′-TGGATGCCAAACCAGAGC-3′，下游引物5′-TCAAAGCGGGTGGAGACC-3′；GAPDH引物：上游引物5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，下游引物5′-AGCTCAGGGATGACCTTGCC-3′。PCR反应条件：95℃、1 min，95℃、15 s，60℃、30 s，共40个循环。每对引物(基因)在每个模板中设3个重复孔，得到的Ct值取平均值；ΔCt=每个目的基因的Ct平均值－对应模板的内参基因(GAPDH)的Ct平均值，实验重复3次。ΔΔCt=实验组ΔCt值－对照组ΔCt值, 实验组和对照组中待测基因的倍数关系以2-ΔΔCt表示。
1.8 Western blotting法检测pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒转染后293T细胞中flag蛋白表达水平293T细胞样本中加入细胞裂解液，待细胞完全裂解后提取细胞蛋白，BCA蛋白定量，样品使用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，每孔上样30 μg蛋白；电泳后转膜，缓冲液封闭，TBST洗涤3次，每次10 min，加入稀释好的单抗兔抗flag单克隆抗体和小鼠抗β-actin；4℃孵育过夜，TBST洗3次，每次15 min；加入稀释好的二抗，室温2 h，TBST洗涤3次，每次15 min。用ECL发光试剂盒进行化学发光检测，凝胶成像系统分析拍照，以β-actin为内参。
1.9 统计学分析采用GraphPad Prism 5统计软件进行统计学分析。2种转染方法的转染效率、TRAF6 mRNA和flag蛋白表达水平以x±s表示，2组间样本均数比较采用两独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 荧光显微镜观察2种转染方法的转染效率转染24和48 h后，与传统磷酸钙转染法(49.3%± 7.02%和64.7%±11.9%)比较，改良磷酸钙转染法转染效率(69.3%±8.02%和94.3%±5.03%)明显升高(P < 0.05)。见图 1和2(插页六)。
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| A, B: Traditional calcium phosphate transfection method; C, D:Improved calcium phosphate transfection method. 图 1 荧光显微镜观察2种磷酸钙转染方法转染293T细胞后24h时转染效率（×200） Fig. 1 Transfection efficiencies of two kinds of calcium phosphate transfection methods 24 h after transfection of 293T cells observed by fluorescence microscope (X200)(seen on page 1179 in paragraph) |
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| A. B:Traditional calcium phosphate transfection method C, D:Improved calcium phosphate transfection method. 图 2 荧光显微镜观察2种磷酸钙转染方法转染293T细胞后48h时转染效率（×200） Fig. 2 Transfection efficiencies of two kinds of calcium phosphate transfection methods 48 h after transfection of 293T cells observed by fluorescence microscope (X200)(seen on page 1179 in paragraph) |
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转染24和48 h后，改良磷酸钙转染法转染293T细胞中TRAF6 mRNA表达水平明显高于传统磷酸钙转染法(P＜0.01)。见表 1。
| (n=3) | |||
| Method | TRAF6 mRNA | ||
| pCDH-GFP-vector | pCDH-GFP-3xflag-TRAF6 24 h(x±s) | pCDH-GFP-3xflag-TRAF6 48 h(x±s) | |
| Traditional calcium phosphate transfection | 1 | 2.4±0.3 | 3.0±0.9 |
| Improved calcium phosphate transfection | 1 | 3.3±0.4* | 5.4±0.6* |
| * P＜0.01 compared with traditional calcium phosphate transfection method. | |||
转染24和48 h后，改良磷酸钙转染法转染293T细胞中flag蛋白表达水平明显高于传统磷酸钙转染法(P＜0.01)。见图 3和表 2。
| (n=3) | |||
| Method | Flag protein | ||
| pCDH-GFP-vector | pCDH-GFP-3xflag-TRAF6 24 h(x±s) | pCDH-GFP-3xflag-TRAF6 48 h(x±s) | |
| Traditional calcium phosphate transfection | 1 | 2.2±0.2 | 3.5±0.4 |
| Improved calcium phosphate transfection | 1 | 3.4±0.8* | 6.2±0.6* |
| * P＜0.01 compared with traditional calcium phosphate transfection method. | |||
影响磷酸钙转染法转染效率的因素很多，如试剂配置的浓度和pH值等[16-17]，因此本研究严格掌握实验试剂的配置方法，特别是pH值的大小和试剂的剂量要求。转染操作步骤严格按照参考文献[2]和本研究步骤。操作的不同点：①传统法要求混旋操作步骤，而本研究的操作步骤无混旋；②本研究操作只要求普通的EP管，传统法要求用圆底试管；③2种方法在质粒DNA、H2O、HEPES和CaCl2的加样方法中存在差别。转染24和48 h后荧光显微镜观察显示：传统磷酸钙转染法转染效率明显低于改良磷酸钙转染法转染效率，表明改良的磷酸钙转染法效率更高。
本研究构建的pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒能够表达TRAF6 mRNA和flag标签蛋白。Real-time PCR法和Western blotting法分别检测2种转染方法转染后24和48 h293T细胞中TRAF6 mRNA和flag蛋白表达水平，结果显示2种方法转染效率不同。本研究结果表明：转染24和48 h，改良磷酸钙转染法转染后293T细胞中TRAF6 mRNA和flag蛋白相对表达水平明显高于传统磷酸钙转染法，表明改良磷酸钙转染法优于传统磷酸钙转染法。
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| Lane 1: pCDH-GFP-vector; Lane 2, 4: pCDH-GFP-3axflag-TRAF6 24 h; Lane 3, 5: pCDH-GFP-3xflag-TRAF6 48 h; Lane 2, 3: Improved calcium phosphate transfection method; Lane 4, 5: Tranditional calcium phosphate transfection method. 图 3 Western blotting法检测2种磷酸钙转染法转染pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒后293T细胞中flag蛋白表达水平 Fig. 3 Electrophoregram of expressions of flag protein in 293T cells after transfection of pCDH-GFP-3xflag-TRAF6 plasmid by two kinds of calcium phosphate transfection methods detected by Western blotting method |
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综上所述，在传统磷酸钙转染法的基础上，经本研究改良的磷酸钙转染法具有更高的转染效率，且无特殊试管及设备的要求，更容易操作，为大规模的病毒包装提供更经济的方法学选择。
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