2019, Vol. 45扩展功能
文章信息
- 刘青菊, 高欣, 邱兵, 王燕, 史凌娜, 高霞
- LIU Qingju, GAO Xin, QIU Bing, WANG Yan, SHI Lingna, GAO Xia
- 槐耳浸膏对嘌呤霉素氨基核苷所致体外小鼠肾小球足细胞损伤的保护作用及其机制
- Protective effect of extractum trametes robiniophila murr on puromycinaminonucleoside-induced podocyte injury in vitro of mice and its mechanism
- 吉林大学学报(医学版), 2019, 45(05): 1020-1024
- Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2019, 45(05): 1020-1024
- 10.13481/j.1671-587x.20190508
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文章历史
- 收稿日期: 2018-12-31
2. 甘肃省人民医院ICU科, 甘肃 兰州 730000;
3. 宁夏医科大学研究生学院, 宁夏 银川 750000;
4. 甘肃省人民医院儿科, 甘肃 兰州 730000
2. Department of ICU, People's Hospital of Gansu Province, Lanzhou 730000, China;
3. Graduate School, Ningxia Medical University, Yinchuan 750000, China;
4. Department of Pediatric, People's Hospital of Gansu Province, Lanzhou 730000, China
足细胞损伤被认为是肾小球滤过屏障功能障碍导致蛋白尿发生的关键因素之一[1]，足细胞损伤最常见的类型是足突融合，在体外最直接的表现为足细胞活动力升高[2]，其可能的机制是骨架重排[3]。研究[4-5]显示：嘌呤霉素氨基核苷(puromycin aminonucleoside, PAN)可以诱导动物足细胞损伤，导致足突融合，破坏肾小球滤过屏障从而发生大量蛋白尿，且与其诱导的骨架蛋白变化密切相关。近年来，足细胞骨架重排在蛋白尿发生机制的研究中越来越被重视。
槐耳是生长在槐树和洋槐等树上的一种真菌，最早的用药历史见于中国明代著名的医药学家李时珍所编录的《本草纲目》[6]。槐耳主要成分为槐耳菌质，主要有效成分为多糖蛋白，目前可采用固体发酵新工艺形成含有槐耳菌丝体多糖等活性成分的槐耳菌质[7]。槐耳浸膏是槐耳菌质经发酵后的热水提取物，是一种棕褐色粉末，含有多种有机成分和十余种矿质元素，其水解产物含有6种单糖和18种氨基酸[8]。研究[9]显示：在肾病综合征大鼠模型中，槐耳能够改善肾小球足突融合，减少蛋白尿的排出并提高血清白蛋白水平, 但其分子机制仍不明确，并且尚未见探讨槐耳对体外足细胞功能影响报道。本研究旨在观察PAN诱导的体外足细胞损伤中，槐耳浸膏对足细胞白蛋白滤过率的影响，分析该影响是否参与调控足细胞活动力及骨架重排。
1 材料与方法 1.1 细胞、主要试剂和仪器体外条件永生化的小鼠足细胞(mouse podocyte clone 5, MPC5)，由美国纽约爱因斯坦大学医学院Mundel教授惠赠；胎牛血清和RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司，PAN购自美国辉瑞公司，槐耳浸膏购自江苏启东盖天力公司，鬼笔环肽单克隆抗体购自美国Invitrogen公司，异硫氰酸荧光素标记的白蛋白(FITC-BSA)购自美国Sigma公司；Millicell-PCF插入式培养皿(内室直径12 mm，膜孔径0.4 μm)购自法国Millipore公司，多功能读板机(美国Molecular Devices公司)，LSM 510激光共聚焦显微镜(德国Carl Zeiss公司)，CO2细胞培养箱(美国Thermo Forma公司)，培养瓶、培养皿、培养板、一次性滤器和冻存管(美国Corning公司)。
1.2 细胞培养及分组永生化小鼠足细胞参照参考文献[10]提供的培养方案培养。体外小鼠永生化足细胞株在33℃、5%CO2条件下，保持上皮细胞形态增殖5 d后转入37℃、5%CO2条件下开始向足细胞分化，分化14 d后显微镜下即可观察到足细胞形态呈长梭型，末端有少量分支，符合文献报道的足细胞形态特征，免疫荧光实验检测足细胞裂孔隔膜固有分子nephrin和podocin表达稳定。本实验所用细胞均为分化成熟的足细胞。将分化成熟的足细胞随机分为对照组、模型组和实验组，对照组不作干预，模型组足细胞以50 mg·L-1 PAN作用24 h[11]，实验组足细胞经10 g·L-1槐耳浸膏预处理1 h后再换用含有50 mg·L-1 PAN的培养液作用24 h。
1.3 FITC-BSA滤过率的检测两室弥散系统装置由24孔细胞培养板的培养孔和Millicell-PCF插入式培养皿组成。足细胞在培养瓶中生长至80%融合时，先用0.25%胰酶-EDTA在37℃消化细胞10~15 min，再以每孔2.5×105个细胞接种于Millicell-PCF插入式培养皿内室中的PCF膜上，在内室补足足细胞培养液至400 μL，外室加入足细胞培养液600 μL，然后置于37℃、5% CO2培养箱中培养48 h后取出，吸出所有培养基。根据不同分组添加不同培养基(对照组细胞用无血清的RPMI 1640培养基；模型组细胞用50 mg·L-1 PAN配制的无血清的RPMI 1640培养基；实验组细胞用10 g· L-1槐耳浸膏配制的无血清RPMI 1640培养基孵育1 h后，再换用50 mg·L-1 PAN配制的无血清的RPMI 1640培养基)继续在上述条件下培养24 h。最后内室和外室中加入无血清和无细胞因子的RPMI 1640培养基培养1 h后，内室换为含0.5 g·L-1 (C上室) FITC-BSA的ECM 400 μL(V上室)，外室换为含0.5 g·L-1未标记BSA的ECM 600 μL，使嵌套内外液面相平和渗透压一致，以消除液面差产生的静压力和渗透压差产生的液体流动对通透性的影响。1 h后从下室收集液体200 μL(V下室)，放于96孔板(黑色)中。采用多功能读板机(M5)测定收集液体在492 nm波长处荧光吸光度(A)值，根据标准曲线计算收集液FITC-BSA浓度，得到下室的浓度(C下室)，FITC-BSA滤过率= [(C下室×V下室)/ (C上室×V上室)]× 100% [11]。
1.4 细胞划痕实验检测足细胞划痕修复率取80%汇合的细胞，胰蛋白酶消化后以每孔1.0×106个细胞接种于6孔培养板上，在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中继续培养24 h，使细胞基本汇合。用无菌10 μL枪头于培养板底部轻轻划出平行和垂直的4条划痕，PBS冲洗若干次，以完全洗去漂浮细胞。待自然晾干培养板后显微镜下观察并拍摄细胞迁移情况。本实验以划痕18 h后为实验终点，PBS洗涤3次，多聚甲醛固定后，DAPI染色细胞核，荧光显微镜下拍片。划痕修复率=(划痕修复面积/最初划痕的面积)× 100%。实验重复3次。
1.5 Transwell细胞迁移实验检测穿膜细胞数将Transwell放入24孔培养板中，使其形成上下2个小室。以0.25%胰酶消化细胞，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中和，离心，以无血清RPMI 1640培养基洗涤细胞2次，重悬于0.5% BSA-1640培养基中，计数细胞，调节浓度为1×106 mL-1。取100 μL细胞悬液加入Transwell上层小室中，下层小室中加入含5%胎牛血清及0.5% BSA的RPMI 1640培养基0.8 mL作为趋化因子。置培养板于37℃、5% CO2培养24 h。培养结束，Transwell膜以甲醇固定30 min，结晶紫染色。用棉签拭去上层小室内Transwell膜表面的细胞，将膜取出并用中性树胶封闭于玻片中。显微镜下观察穿过Transwell膜的细胞并拍照，随机选取5~8个视野计数并统计穿膜细胞数，穿膜细胞数与细胞的迁移能力呈正比。实验重复3次。
1.6 免疫荧光单标的激光共聚焦实验检测足细胞的骨架重排以1.5 IU·L-1鬼笔环肽标记各组足细胞F-actin作为足细胞肌动纤维的观察指标，具体步骤见商品说明书，用LSM 5.0软件系统在Carl zeiss激光共聚焦显微镜下拍照，并测算平均荧光强度(mean fluorescent intensity，MFI)，即F-actin表达水平。足细胞骨架重排情况：每片随机选择4个视野共200个细胞，每组4张片子。F-actin杂乱解聚者计1分，光滑均匀者计0分，非典型者计0.5分，F-actin重排率=(总计分/200)× 100%。
1.7 统计学分析采用SPSS 11.5统计软件进行统计学分析。各组细胞FITC-BSA滤过率、足细胞划痕修复率、穿膜细胞数、F-actin表达水平和F-actin重排率以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组体外足细胞的FITC-BSA滤过率与对照组(8.40%±0.45%)比较，模型组体外足细胞FITC-BSA滤过率(37.85%±3.40%)明显升高(P＜0.01)；与模型组比较，实验组体外足细胞FITC-BSA滤过率(18.18%±0.97%)明显降低(P＜0.01)。
2.2 各组体外足细胞划痕修复率和穿膜细胞数与对照组(23.75%±4.27%)比较，模型组足细胞划痕修复率(72.50%±4.27%)明显增高(P＜0.01)；与模型组比较，实验组足细胞划痕修复率(33.75%±4.27%)明显降低(P＜0.01)。显微镜观察显示：实验组穿过Transwell膜的足细胞数较模型组明显减少。与对照组(63.200±8.206)比较，模型组穿膜细胞数(115.600±15.910)明显增多(P＜0.05)；与模型组比较，实验组穿膜细胞数(72.800±9.238)明显降低(P＜0.05)。见图 1。
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| A:Control group; B:Model group; C:Test group. 图 1 显微镜下观察各组穿过Transwell膜的足细胞(×400) Fig. 1 Podocytes passing through Transwell membrane in various groups observed under microscope(×400) |
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正常组足细胞荧光强度表达均匀，细胞骨架肌动纤维丝排列保持一致极性，肌纤维结构清晰均匀；模型组足细胞F-actin紊乱不均匀，部分荧光强度增强，胞膜间连接不连续，胞浆内荧光强度变暗，应力纤维几乎消失；实验组足细胞F-actin排列紊乱有所改善，F-actin分布重新趋于正常状态，荧光强度增强(图 2A，见插页二)。共聚焦显微镜LSM 5.0软件系统定量分析荧光强度显示：与对照组(1012.00±20.34)比较，模型组足细胞中F-actin表达水平(448.60±46.39)明显降低(P＜0.01)，荧光分布杂乱；与模型组比较，实验组足细胞中F-actin表达水平(745.70±29.49)明显升高(P＜0.01)，荧光分布较均一。与对照组(35.00%±2.49%)比较，模型组足细胞F-actin重排率(91.20%±0.68%)明显升高(P＜0.01)，足细胞骨架结构紊乱；与模型组比较，实验组足细胞F-actin重排率(66.50%±1.38%)明显降低(P＜0.01)，骨架重排情况明显缓解。见图 2B和C(插页二)。
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| A：Control group；B：Model group；C：Test group. 图 2 激光共聚焦显微镜下观察各组足细胞中F-actin排列情况(×400) Fig. 2 Arrangement of F-actin in podocytes in various groups observed under laser confocal microscope (×400) |
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槐耳具有抗肿瘤[12-13]和免疫调节[14]等多重药理作用。体外研究[15]显示：槐耳浸膏能够明显增强人巨噬细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)的活化能力。近年来，以槐耳为主要成分的中成药在肾病综合征[16-18]、IgA肾病[19-20]和紫癜性肾炎[21]等疾病中取得了良好的治疗效果。研究[16, 20]显示：槐耳降低了肾脏原发疾病的复发或加重次数，其原因可能是槐耳减少了患者感染的机会。同时，动物实验研究[9, 22]显示：槐耳能够缓解肾病综合征大鼠的足突融合及蛋白尿程度，提示槐耳可能直接参与缓解肾病足细胞损伤。
本研究旨在利用槐耳浸膏对体外足细胞损伤模型开展相关实验研究，进一步了解槐耳提取物是否能够直接缓解足细胞损伤。本研究结果显示：经槐耳浸膏预处理后的足细胞，在给予PAN后，BSA滤过率较无预处理的足细胞明显下降，表明槐耳浸膏在体外能够直接改善足细胞对白蛋白的滤过水平，提示其对PAN所致小鼠肾小球足细胞损伤具有保护作用。
为了探讨槐耳浸膏直接缓解体外足细胞损伤的可能机制，本实验重点分析了该药物对体外足细胞活动力及骨架重排的影响。划痕实验是体外反应足细胞活动力变化最直观的实验方法，体外足细胞活动力升高也是体内足细胞发生足突融合和骨架重排最直接的证据[11]。本研究结果显示：经槐耳浸膏预处理的足细胞，当再给予PM刺激后，细胞划痕修复率和穿膜细胞数均较未予槐耳浸膏预处理的足细胞明显降低，表明槐耳浸膏能够减轻病理状态下足细胞活动力升高的程度，这可能是槐耳浸膏改善肾病大鼠足细胞足突融合的分子机制之一。
足细胞细胞骨架重排是导致足细胞活动力升高的分子基础，而肌动蛋白是维持足细胞细胞骨架稳定的主要结构，肌动蛋白最主要的组成分子是F-actin[23]。本实验使用鬼笔环肽直接荧光标记足细胞骨架蛋白F-actin后，观察细胞骨架重排情况，结果显示：槐耳浸膏能够增加足细胞肌动蛋白F-actin表达水平，明显改善PAN导致的足细胞细胞骨架重排现象。本研究结果表明：槐耳浸膏可能是通过稳定病理状态下足细胞的骨架结构，进而缓解足细胞骨架重排程度，降低足细胞活动力，最终改善病理状态下足细胞对白蛋白的滤过水平。
综上所述，本研究初次在体外实验中验证了槐耳浸膏对足细胞损伤的直接保护作用，并揭示了槐耳浸膏能够通过稳定足细胞细胞骨架，直接减轻病理状态下足细胞活动力升高的程度，最终改善足细胞对BSA的滤过率。本课题组将深入开展参与槐耳浸膏改善足细胞损伤可能的信号分子研究，希望通过分子生物学实验逐渐明确槐耳治疗肾病的分子机制，为今后肾病治疗提供新的药物选择。
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