2019, Vol. 45扩展功能
文章信息
- 李梦红, 姜欢, 王六一, 冯旭, 刘楠, 胡敏
- LI Menghong, JIANG Huan, WANG Liuyi, FENG Xu, LIU Nan, HU Min
- 熊果酸对小鼠成牙骨质细胞系OCCM-30细胞分化的促进作用
- Promotion effect of ursolic acid on differentiation of mouse cementoblast cell line OCCM-30 cells
- 吉林大学学报(医学版), 2019, 45(05): 986-991
- Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2019, 45(05): 986-991
- 10.13481/j.1671-587x.20190502
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文章历史
- 收稿日期: 2019-01-26
2. 吉林省牙发育与颌骨重塑及再生重点实验室, 吉林 长春 130021
2. Key Laboratory of Dental Development and Jaw Remodeling and Regeneration of Jilin Province, Changchun 130021, China
正畸牙移动是围绕牙根的相关骨组织和周围的软组织在结构和形态上发生动态变化的结果。在这一过程中，20%以上牙根会发生不同程度的吸收[1]，具体表现为根面凹陷、牙根变短及牙齿松动甚至脱落[2]。尽管多数牙根吸收不会危及牙齿的生理功能和生存状态，但由于其多发性和高发性，已受到正畸学者的广泛关注[1]。成牙骨质细胞附着于牙根表面，其可以形成前期牙骨质，后经矿化为成熟牙骨质，在牙根吸收的修复过程中起重要作用[3]。熊果酸是在植物界分布极为广泛的一种五环三萜类化合物，可从希腊鼠尾草和夹竹桃等植物中提取[4]。近年来，研究者着重于研究熊果酸在骨重塑方面的作用发现：其可以刺激成骨细胞分化，提高新骨形成，抑制骨吸收，因此被用于治疗骨质疏松症等[5-9]。熊果酸也可以促成骨样细胞小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)中骨保护素(OPG)、雌激素受体(ER)和磷脂肌醇(PKC)的表达，此作用与核因子κB(NF-κB)通路相关[10]。本文作者在前期研究[11]中发现：以一定浓度的熊果酸刺激矿化诱导中的成牙骨质细胞系OCCM-30细胞，可以提高其碱性磷酸酶(ALP)活性，促进矿化结节的形成，但熊果酸对于OCCM-30细胞矿化相关机制的调控尚不明确。本实验以一定浓度的熊果酸作用于OCCM-30细胞，检测其对OCCM-30细胞增殖抑制率、ALP活性以及骨桥蛋白(OPN)mRNA和蛋白表达水平的影响，为牙根吸收的修复提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 细胞、主要试剂和仪器成牙骨质细胞系OCCM-30细胞(四川大学华西口腔医院白丁教授惠赠)；熊果酸单体(美国Sigma公司，产品代码897977，纯度99.8%)，ALP试剂盒和BCA法蛋白定量试剂盒(南京建成生物工程研究所)，细胞培养基和双抗(美国Hyclone公司)，胰酶和小牛血清(美国Gibco公司)，OPN抗体(美国Abcam公司)，实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)试剂盒(日本TaKaRa公司)；细胞培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)。
1.2 引物序列OPN和β-actin引物序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成，所用引物序列如下：OPN上游引物，5′-AGCTTGGCTTATGGACTGAGG-3′, 下游引物, 5′-CAGGGATGACATCGAGGGAC-3′; β-actin上游引物, 5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3′, 下游引物, 5′-ATGGAGCCACCGATCCACA-3′。
1.3 成牙骨质细胞的培养采用含有10%小牛血清、1%双抗的高糖DMEM培养液培养OCCM-30细胞。置于37℃、含5%CO2、饱和湿度培养箱中，细胞生长至80%时在无菌条件下传代，用预热PBS清洗3次，用0.5 mL胰蛋白酶消化细胞，显微镜下见细胞变圆，开始脱落时用含血清的培养液终止反应，1 000 r·min-1离心5 min后弃去上清液，加入新鲜培养基，吹散细胞制成悬液，按1:3传代，每2 d换液，选择对数生长期细胞用于实验。
1.4 MTT法检测细胞增殖抑制率用胰蛋白酶消化OCCM-30细胞，以每孔5×103个细胞接种于96孔板中，培养24 h后进行分组，每组均设3个复孔，对照组和不同浓度熊果酸组分别加入0、0.625、1.250和2.500 μmol·L-1熊果酸，分别在加入熊果酸24、48和72 h后，每孔加入10 μL浓度为5g·L-1的MTT溶液，置于培养箱中孵育4 h后小心吸干培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，室温置于摇床上10 min后，使用酶标仪在490 nm波长处检测各孔吸光度(A)值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(1－实验组A值/对照组A值)×100%。
1.5 碱性磷酸酶法检测细胞矿化以每孔1×105个细胞接种到6孔板中，24 h后分为对照组和熊果酸组，分别加入0和2.500 μmol· L-1熊果酸于高糖培养液中，隔日换液，在加药后1、3、5和7 d检测细胞中ALP水平，按照试剂盒说明书操作。每孔细胞用1 mL预冷PBS洗2次，再用100 μL细胞裂解液RIPA裂解细胞，4℃、13000 r · min-1离心10 min后，取上清液用试剂盒检测ALP活性，每组设置3个复孔，在520 nm波长处检测各孔A值，并采用BCA试剂盒检测蛋白质总量。ALP活性(U·g-1)=(测定孔A值－空白孔A值)/(标准孔A值－空白孔A值)×酚标准品浓度(0.1 g·L-1)/待测样本蛋白浓度(g·mL-1)。
1.6 RT-PCR法检测细胞中OPN mRNA表达水平OCCM-30细胞以每孔1×105个接种到6孔板中，24 h后进行分组，分别加入浓度为0.625、1.250和2.500 μmol·L-1的熊果酸于高糖培养液中，对照组不加任何刺激，隔日换液，在加药后3、6、12、18和24 h分别提取各组总RNA，按照cDNA合成试剂盒操作说明将所得总RNA逆转录为cDNA，RT-PCR反应参照试剂盒说明书，目的基因为OPN，内参为β-actin。采用2－ΔΔCt法计算OPN mRNA相对表达水平。
1.7 Western blotting法检测细胞中OPN蛋白表达水平细胞分组及药物刺激同1.6，在加药后3和5 d分别提取总蛋白。即PBS冲洗2次，用细胞裂解液RIPA(加入1‰蛋白酶抑制剂)裂解细胞，4℃、13 000 r · min-1离心10 min后提取上清液，采用BCA试剂盒检测蛋白表达水平。根据样品体积加入适量的4×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，煮沸变性。配置SDS-PAGE凝胶后，上样，进行电泳及转膜。然后将PVDF膜浸于5%BSA中孵育1 h。加入一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜后，37℃孵育二抗1.5 h，TRST洗膜后置于曝光机内显影，并采用Gel Image System 4.2软件测量各条带的面积及灰度值。以β-actin为内参，以OPN/β-actin条带灰度值比值表示OPN蛋白表达水平。
1.8 统计学分析采用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析。各组OCCM-30细胞增殖抑制率、ALP活性、OPN mRNA和蛋白表达水平均符合正态分布及方差齐性，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组OCCM-30细胞增殖抑制率与对照组比较，不同浓度(0.625、1.250和2.500 μmol·L-1)的熊果酸作用细胞24、48和72 h，细胞增殖抑制率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表 1。
| (n=3, x ±s, η/%) | |||
| Group | Inhibitory rate of proliferation | ||
| (t/h) 24 | 48 | 72 | |
| Ursolic acid(μmol·L-1) | |||
| 0.625 | 0.070±0.007 | 0.100±0.070 | 0.040±0.005 |
| 1.250 | 0.070±0.020 | 0.120±0.060 | 0.080±0.040 |
| 2.500 | 0.070±0.005 | 0.050±0.030 | 0.080±0.040 |
| F | 0.315 | 1.184 | 0.708 |
| P | 0.741 | 0.369 | 0.529 |
| * P < 0.05 compared with control group. | |||
与对照组(3.580±0.007)比较，2.500 μmol·L-1熊果酸作用3、5和7 dOCCM-30细胞中ALP活性(4.030±0.140，4.840±0.060，6.060±0.080)明显升高(P < 0.05)。提示熊果酸能有效诱导OCCM-30细胞成骨分化。
2.3 各组OCCM-30细胞中OPN mRNA和蛋白的表达水平与对照组比较，不同浓度熊果酸组OCCM-30细胞中OPN mRNA表达水平均明显升高；各组总体均数比较差异有统计学意义(P < 0.01)。与对照组比较，0.625 μmol·L-1熊果酸作用6hOPNmRNA表达水平开始升高(P < 0.05)，12h时OPN mRNA的表达水平达到峰值，约为对照组的6倍；与对照组比较，1.250μmol·L-1熊果酸组作用3h时OPN mRNA表达水平即升高(P < 0.05)，作用6h时，OPN mRNA表达水平达到峰值，约为对照组的3.48倍；与对照组比较，2.500 μmol·L-1熊果酸组作用6h时OPN mRNA表达水平明显升高(P < 0.05)，约为对照组的8倍。见表 2。
| (n=3, x ±s) | |||||
| Group | Expression level of OPN mRNA | ||||
| (t/h) 3 | 6 | 12 | 18 | 24 | |
| Control | 1.000±0.050 | 1.000±0.170 | 1.000±0.050 | 1.000±0.020 | 1.000±0.100 |
| Ursolic acid(μmol·L-1) | |||||
| 0.625 | 0.950±0.040 | 1.190±0.030* | 5.870±0.470* | 2.900±0.290* | 0.980±0.130 |
| 1.250 | 1.990±1.140* | 3.480±0.470* | 0.890±0.020 | 1.040±0.110 | 1.000±0.050 |
| 2.500 | 0.980±0.006 | 7.950±0.100* | 1.600±0.140* | 1.060±0.120 | 1.000±0.070 |
| F | 126.008 | 478.318 | 279.342 | 93.151 | 0.046 |
| P | < 0.01 | < 0.01 | < 0.01 | < 0.01 | 0.986 |
| * P < 0.05 compared with control group. | |||||
Western blotting法检测结果显示：在不同浓度熊果酸作用后3和5d，与对照组比较，不同浓度熊果酸组OCCM-30细胞OPN蛋白表达水平明显升高(P < 0.01)。见图 1和表 3。
|
| A:3d; B:5d.Lane 1: Control group; Lane2-4: 0.625, 1.250, and 2.500 μmol·L-1 ursolic acid groups. 图 1 各组OCCM-30细胞中OPN蛋白表达电泳图 Fig. 1 Electrophoregram of expressions of OPN protein in OCCM-30 cells in various groups |
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|
| (n=3, x ±s) | |||
| Group | Expression level of OPN protein | ||
| (t/d) 3 | 5 | ||
| Control | 1.180±0.060 | 1.180±0.005 | |
| Ursolic acid(μmol·L-1) | |||
| 0.625 | 1.450±0.020* | 4.470±0.070* | |
| 1.250 | 3.410±0.060* | 6.980±0.130* | |
| 2.500 | 6.820±0.060* | 7.270±0.100* | |
| F | 7 392.429 | 3 111.385 | |
| P | < 0.01 | < 0.01 | |
| * P < 0.05 compared with control group. | |||
熊果酸具有毒性低和不良反应小等优势，目前已被广泛应用于保肝、抗癌和抗病毒等方面。近年来，因其具有促进骨形成和抑制骨吸收的特性，已经作为抗骨质疏松药的主要成分被广泛应用于临床。熊果酸可通过激活促分裂原活化蛋白激酶、NF-κB以及活化蛋白-1来调控OPN和骨钙素(OCN)等的表达[6]；研究[12]表明：在成骨细胞中，高表达的Runx2可以激活OCN和OPN的转录及表达，进而促进骨成熟。
本课题组前期研究结果[11]显示：适宜浓度熊果酸可以上调成牙骨质细胞ALP表达和矿化结节形成量，促进成牙骨质细胞矿化。但不同浓度的熊果酸如何影响矿化相关标志物在基因和蛋白水平的表达尚未明确。为研究这一问题，本实验以OCCM-30细胞系为研究对象，参考前期实验结果设定熊果酸浓度梯度，首先采用MTT法检测熊果酸对细胞增殖的影响，结果显示：熊果酸组细胞增殖抑制率无明显变化，实验结果与前期研究结果基本一致[11]。
ALP是成骨细胞分泌的一组膜结合糖蛋白，是成骨细胞早期分化的特异性标志，与骨组织重建和骨基质矿化密切相关[13]。ALP活性的高低，能较客观地反映成骨细胞分化成熟的程度[14]。本实验中，与对照组比较，作用3、5和7 d熊果酸组ALP活性升高(P < 0.05)，提示熊果酸可促进细胞矿化。
与前期细胞培养条件不同，本实验采用高糖DMEM培养液，而不是矿化诱导液培养细胞诱导分化，在此培养条件下，OCCM-30细胞ALP活性增强，故而推断熊果酸具有诱导成牙骨质细胞分化的作用，其促进矿化的作用可不依赖于矿化诱导液的存在。
本文作者研究熊果酸作用下OCCM-30细胞中多种矿化相关标志物在基因和蛋白水平的表达情况，结果显示：其中OPN上调最为稳定和明显。OPN是一种多功能、分泌型糖蛋白，主要表达于骨形成早期，是成骨细胞的特征性表型标志，可由成骨细胞分泌并储存于骨基质中，将自身同骨基质连接，促进矿化组织的重建[15]。在口腔医学中，OPN可以促进牙体和牙槽骨的形成和矿化[16]；在骨质疏松症的研究中，OPN是矿化特异性标志物之一，其表达水平下降表征骨流失及骨质疏松[17-18]。但也有研究[19]显示：OPN对成骨细胞增殖和分化具有抑制作用，成为引发骨质疏松症及其他骨质缺失疾病的重要原因。上述差异可能归因于不同的实验体系或研究条件，亦或与其翻译后修饰形式以及相关靶细胞的受体表达差异等多重因素有关。本研究结果显示：与对照组比较，在熊果酸浓度为1.250 μmol·L-1时，OPN mRNA表达水平明显升高(3 h)；在熊果酸浓度为2.500 μmol·L-1时，OPN mRNA表达水平上调最明显(约为对照组的8倍)，OPN蛋白表达水平上调也最为明显(约为对照组的7倍)。
近年来，熊果酸在骨重塑机制方面的研究已日趋广泛，熊果酸在骨形成过程中可以促进前成骨细胞的增殖、刺激成骨细胞和前成骨细胞的分化，还可以抑制成骨细胞的凋亡，从而实现对骨形成的促进作用[20]；在骨吸收过程中，能够抑制破骨前体细胞分化，阻碍破骨细胞的骨吸收，从而实现对骨吸收的抑制作用[21-22]。但是对于熊果酸促进成牙骨质细胞矿化，亦或抑制破骨细胞吸收的机制，目前尚不十分明确。本课题组下一步将以OPN上调为切入点，探寻熊果酸促进成牙骨质细胞矿化的相关信号通路，为正畸过程中牙根吸收的治疗提供依据。
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