2019, Vol. 45扩展功能
文章信息
- 王宁宁, 徐志民, 郑叶, 张赢心, 韩冰
- WANG Ningning, XU Zhimin, ZHENG Ye, ZHANG Yingxin, HAN Bing
- 聚多巴胺涂层3D打印双相磷酸钙组织工程支架的制备及其评价
- Preparation of polydopamine coated 3D printed biphasic calcium phosphate tissue engineering scaffold and its evaluation
- 吉林大学学报(医学版), 2019, 45(04): 955-959
- Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2019, 45(04): 955-959
- 10.13481/j.1671-587x.20190438
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文章历史
- 收稿日期: 2019-03-12
创伤或肿瘤切除术等均会导致大面积的骨组织缺损，严重影响患者生活质量[1]。组织工程技术的出现为骨缺损的修复治疗带来希望[2]。骨组织工程支架材料以磷酸钙类生物陶瓷研究居多，其成分与天然骨无机成分相似，并已被证明具有骨诱导活性[3]。双相磷酸钙(biphasic calcium phosphate, BCP)是由羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)和β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate，β-TCP)按照一定比例混匀形成的双相无机物，除具有优良的生物学相容性、骨诱导性及骨传导性以外，材料的降解速率可以通过调整HA与β-TCP的比例进行控制，故在骨组织工程研究中得到广泛应用[4-5]，但BCP材料在细胞聚集及趋化方面活性较低，所以在将细胞种植到支架上时，多数细胞无法黏附及聚集在其表面或内部微孔[6]。为增强磷酸钙类物质的骨修复效果，许多研究人员使用丝素蛋白[7]、胶原[8]、石墨烯[9]和壳聚糖[10]等对支架进行改性，但成骨效果一般，可操作性不强。多巴胺(dopamine，DA)作为超强黏附性贻贝的黏蛋白功能单元，聚合后形成的聚多巴胺(polydopamine，PDA)可作为材料表面涂层增强支架的细胞黏附性能。本文作者拟采用PDA对3D打印的BCP支架(3DBCP)进行表面改性，探讨涂层前后支架的表征及对小鼠前成骨细胞系(MC3T3-E1)的黏附及增殖状态的影响，为该材料应用于骨组织工程奠定理论基础。
1 材料与方法 1.1 材料、主要试剂和仪器HA、β-TCP和DA(上海阿拉丁生化试剂科技股份有限公司)，CCK-8试剂盒(日本同仁研究所)。扫描电子显微镜(SEM，德国蔡司公司)，材料试验机(美国INSTRON公司)，酶标仪(美国Bio-RAD公司)。
1.2 3DBCP支架的制备使用300目金属筛网对HA和β-TCP粉末进行颗粒的筛选细化，使颗粒的直径约为50 μm。称取10 g聚乙烯醇加入90 mL蒸馏水，95℃条件下搅拌约2h至完全溶解，打印粘结剂制备完成。称取等质量的HA/β-TCP混合粉末(质量比4/6)和聚乙烯醇(PVA)水溶液，充分搅拌混匀，使混合物呈有一定黏度及流动性的浆糊状。根据预设程序控制打印机在接收器表面定向移动分层打印，直至整个支架打印完成。将模型放置在干燥器里室温下干燥24h，根据预设程序对打印支架进行烧结处理。制备完成的支架为10 mm×10 mm×2 mm长方体(图 1A)。
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| 图 1 3DBCP支架(A)和PDA-3DBCP支架(B)的外观形貌 Fig. 1 Photographs of 3DBCP(A) and PDA-3DBCP(B) scaffolds |
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称取0.08g三羟甲基氨基甲烷(Tris)置于500 mL容量瓶中，加入400 mL超纯水，将溶液的pH调至8.5后再加入100 mL超纯水定容，制得10 mmol·L-1、pH8.5的Tris-HCl缓冲溶液，常温密封保存，备用。称取200 mg DA溶于100 mL上述缓冲溶液，置于37℃、150 r·min-1摇床中过夜，制成2 g·L-1 PDA溶液。将烧结成型的3DBCP支架浸泡在PDA溶液中，置于37℃、150 r·min-1摇床过夜，取出支架后使用超纯水冲洗未涂覆的PDA即为PDA-3DBCP支架。干燥后经环氧乙烷灭菌，密封，备用(图 1B)。
1.4 支架表面形貌和亲水性表征采用扫描电子显微镜观察改性前后支架的形貌。加速电压为5kV。支架的水接触角可反映材料的亲水性。室温下将2 μL Mili-Q超纯水自支架上方2 cm处滴下，与表面接触瞬时拍照并计算接触角。
1.5 支架孔隙度测量通过液体置换法对支架孔隙度进行测量，即支架内部孔隙体积与支架总体积的比值，结果以百分率表示。将干燥支架放入比重瓶称质量(Wps)，乙醇完全填充比重瓶称质量(Wpse)，去除支架称残余乙醇和比重瓶质量(Wpr)，干燥比重瓶称质量(Wp)，观察比重瓶容积(Vp)和当前室温下乙醇密度(ρe)。按照如下公式计算孔隙度(Φ)：Φ=[(Wpse-Wps)-(Wpr－Wp)]/ρe/[Vp-(Wpr－Wp)/ρe]×100%。
1.6 支架机械强度检测采用材料试验机测试样品的机械强度，测试条件：加载速度0.5 mm·min-1，加载负荷1000 N。结果以机器测量的压缩模量数值来表示。
1.7 细胞增殖活性检测各组支架分别置于96孔板中，各孔分别滴加含2000个细胞的悬液20 μL至支架上后预培养1h，再向每孔加入180 μL增殖培养基继续培养。隔天换液。采用CCK-8试剂盒检测MC3T3-E1细胞在多孔支架上培养1、3和5 d时的增殖活性。按照CCK-8试剂盒说明，使用自动酶标分析仪检测450nm波长处的待测液体吸光度(A)值，间接反映检测样本中的细胞增殖活性。
1.8 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。支架表面水接触角、支架内部孔隙度、支架机械强度和细胞增殖活性均符合正态分布，均以x ±s表示，2组间比较采用t检验。以P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 支架的结构3DBCP支架和PDA-3DBCP支架均为扁平的方块状结构，孔隙大小均匀，约0.5mm，孔隙间相互连通。与3DBCP支架比较，PDA-3DBCP支架外观呈棕褐色。见图 1。
2.2 扫描电子显微镜观察支架表面超微结构2组支架表面均较粗糙且有微孔。与3DBCP组比较，PDA-3DBCP组支架表面的粗糙度稍增加，但支架的整体孔隙无明显改变。见图 2。
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| 图 2 扫描电子显微镜观察3DBCP组(A)和PDA-3DBCP组(B)支架表面的超微结构(Bar=2 μm) Fig. 2 Ultrastructures of scaffold surface in 3DBCP group(A)and PDA-3DBCP (B) observed by SEM(Bar=2 μm) |
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与3DBCP组支架水接触角(94.93°±3.08°)比较，PDA-3DBCP组支架水接触角(79.55°±6.10°)明显缩小(t=5.06，P < 0.05)。
2.4 2组支架的孔隙度3DBCP组和PDA-3DBCP组支架的孔隙度分别为(61.49±2.54)%和(62.63±2.47)%，组间比较差异无统计学意义(t=0.103，P>0.05)。
2.5 2组支架的机械强度3DBCP组和PDA-3DBCP组支架的机械强度(即压缩模量)分别为(26.5±6.35)和(26.2±2.09)MPa，组间比较差异无统计学意义(t=0.002，P>0.05)。
2.6 2组支架上细胞增殖活性MC3T3-E1细胞接种到支架上1 d后，PDA-3DBCP组细胞增殖活性略高于3DBCP组，但组间比较差异无统计学意义(t=0.639，P>0.05)。随着培养时间的延长，至第5天时，2组支架细胞增殖活性较第3天时均明显升高(t3DBCP=11.077，P < 0.01；tPDA-3DBCP=11.168，P < 0.01), 且第5天时PDA-3DBCP组细胞增殖活性高于3DBCP组(P < 0.05)。见表 1。
| (n=6, x ±s) | |||
| Group | Proliferation activity | ||
| (t/d) 1 | 3 | 5 | |
| 3DBCP | 0.156±0.024 | 0.289±0.024 | 0.633±0.018* |
| PDA-3DBCP | 0.187±0.030 | 0.305±0.040 | 0.790±0.018*△ |
| *P < 0.01 compared with 3 d; △P < 0.05 compared with 3DBCP group. | |||
颅面部骨缺损常伴有软组织缺失，严重影响患者的生活质量。目前使用的医学重建技术主要包括局部组织瓣转移及显微外科相关的自体或同种异体移植。局部组织瓣转移因组织来源有限，无法应用于较大的缺损；显微外科移植存在供体部位愈合不良及受体部位皮瓣坏死脱落的风险[2-3]。组织工程技术为骨缺损的修复治疗带来希望[11-12]。
骨组织工程的研究内容主要集中在无机生物陶瓷支架的制备及开发领域[13]。生物陶瓷包括磷酸钙类生物陶瓷和生物玻璃，其中磷酸钙类生物材料中β-TCP和HA常被用于骨组织工程支架的改性，以提高其成骨活性[14]。本课题组前期研究[15-16]初步探讨了3D打印BCP支架的表面形态和物理化学性能，结果证明：3DBCP支架基本符合骨组织工程支架的要求，通过原子力显微镜和扫描电子显微镜可见支架具有良好的微观形貌。但BCP材料在细胞聚集及趋化方面活性较低，所以在将细胞种植到支架上时，多数细胞无法黏附及聚集在其表面或内部微孔[6]。为增强磷酸钙类物质的骨修复效果，许多研究人员采用各种方法[7-10]对支架进行改性，部分学者还通过水凝胶[17]等载体包裹成骨诱导性物质加入到修复材料中以达到缓释的效果。
DA在碱性和有氧条件下会发生自组装表面修饰，形成厚度约50 nm的PDA单分子涂层，其残端带有丰富的胺基和酚羟基可作为二级反应平台, 固定生物活性分子以及细胞等[18-20]。故通过PDA涂层来增强支架的细胞黏附性能是一种可行的改性方法。此外，支架的制备技术也会通过相应的表观形貌来影响材料的成骨性能。传统的多孔生物陶瓷骨组织工程支架的制备方法有颗粒堆积法、冷冻干燥法、模板复制法、溶胶凝胶法、静电纺丝法、直接发泡法和自牺牲模板法等，但上述方法对单个孔隙的形状和尺寸控制均有限[21-24]。3D打印技术是一种快速成型的增材制造方法，多用于热塑性聚合物复杂结构的精准加工，但在具有复杂结构生物陶瓷的成型方面，3D打印技术仍具有挑战性[25-26]。
本研究使用PDA对3DBCP支架涂层以达到提高材料表面亲水性的目的，探讨改性前后支架性质特点及与MC3T3-E1共同培养时对细胞活力的影响，结果显示：制备完成的PDA-3DBCP支架外观规则，孔隙大小均匀且相互连通，外观呈棕褐色，这种颜色改变与PDA的氧化有关；PDA涂层使3DBCP支架表面粗糙度稍增加，但未对支架整体孔隙产生影响，说明用该浓度的PDA溶液浸泡支架进行改性不会破坏支架本身的孔结构。这种多级孔径结构为细胞生长提供了更大的生长空间，而且有利于细胞生长过程中所需养分和代谢废物的运输[27]。
本研究结果显示：与3DBCP组比较，PDA-3DBCP支架表面的水接触角明显缩小，支架孔隙度和机械强度差异无统计学意义。本研究结果表明：PDA改性后的支架表面亲水性明显增加，有效降低了3DBCP表面的疏水性，从而更有利于细胞黏附生长[28-29]；对原支架孔隙结构未造成明显影响，保持原有支架高度孔隙率的特征，具有高比表面积，从而有利于细胞的黏附和增殖，促进细胞在支架上聚集[30-31]；同时，PDA改性的一系列操作并未对支架强度方面造成负面影响，有利于骨组织修复区的力学承载，以保持原有的组织结构框架完整[32-33]。
MC3T3-E1细胞在支架上的增殖活性是通过CCK-8方法进行评估分析的。本研究结果显示：随着细胞培养时间的延长，3DBCP和PDA-3DBCP支架上的细胞数明显增加，表明2组支架的细胞相容性均较为理想；同时，培养至第5天时PDA-3DBCP支架上细胞数明显高于3DBCP组，表明随着培养时间的增加，MC3T3-E1细胞在PDA-3DBCP支架上的吸附、生长和增殖均优于未改性3DBCP支架，可能与PDA涂层分子自带基团增强支架对细胞的黏附有关[18]。
综上所述，采用3D打印技术制备的BCP支架具备良好的三维立体结构，经PDA涂层改性后可明显提高支架表面的亲水性能，从而有效促进细胞的黏附和增殖活性。本研究初步验证了PDA-3DBCP支架在骨组织工程中的应用潜力，为后续实验及其临床应用提供了理论依据。
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