2019, Vol. 45扩展功能
文章信息
- 杨东伟, 桂雨农
- YANG Dongwei, GUI Yunong
- BRD4基因对TGF-β1诱导的心肌细胞凋亡和p38MAPK信号通路的影响
- Effects of BRD4 gene on apoptosis and p38MAPK signaling pathway of cardiomyocytes induced by TGF-β1
- 吉林大学学报(医学版), 2019, 45(04): 855-860
- Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2019, 45(04): 855-860
- 10.13481/j.1671-587x.20190419
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文章历史
- 收稿日期: 2019-03-08
2. 新乡医学院全过程教学基地, 河南 新乡 453000
2. Whole Process Teaching Base, Xinxiang Medical College, Xinxiang 453000, China
转化生长因子β1 (transforming growth factor-β1，TGF-β1)是TGF-β超家族的重要分子之一，是一种调控细胞生长的重要细胞因子，参与细胞增殖、细胞凋亡、胚胎发生、免疫调节及骨髓造血等过程的调控[1]。研究[2-3]表明：TGF-β1参与心力衰竭、心肌梗死、心肌肥厚和心肌病等多种心血管疾病的发生发展。心肌细胞凋亡贯穿于心血管疾病发生发展的整个过程[4]，因此抑制TGF-β1诱导的心肌细胞凋亡对于心血管疾病治疗具有重要意义。溴结构域蛋白4(bromodomain-containing protein 4，BRD4)是溴结构域和超末端结构家族成员，可通过招募不同的转录因子调节靶基因表达，在炎症、细胞周期和细胞基因转录等调节过程中发挥重要作用[5]。目前BRD4在心血管疾病中的研究较少，有研究[6]显示：抑制BRD4表达可通过核因子κB(NF-κB)信号降低心肌梗死模型大鼠心肌细胞凋亡率。提示BRD4可能在心血管疾病发生发展过程中起重要作用。本研究采用TGF-β1诱导建立心肌细胞凋亡模型，观察细胞活力和细胞凋亡率变化，研究抑制BRD4表达对TGF-β1诱导的大鼠H9c2心肌细胞凋亡的影响，并初步探讨其作用机制。
1 材料与方法 1.1 细胞株、主要试剂和仪器大鼠心肌细胞株H9c2购自中科院上海细胞研究所细胞库。DMEM培养基和胎牛血清(FBS)均购自美国Gibco公司，LipofectamineTM2000试剂盒购自美国Invitrogen公司，TGF-β1和MTT试剂盒购自美国Sigma公司，Annexin Ⅴ-FITC/PI双染细胞凋亡试剂盒购自南京凯基公司，BRD4、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase3)、P38和磷酸化P38(p-P38)抗体均购自美国CST公司。FC型酶标仪购自美国Thermo公司。
1.2 细胞培养H9c2细胞置于含10% FBS的DMEM完全培养液中，于37℃恒温、5%CO2和饱和湿度培养箱培养。生长至对数期的细胞用于实验。
1.3 实验分组和处理首先将H9c2细胞分为空白对照组、si-CN组(转染阴性对照siRNA)和si-BRD4组(转染BRD4特异性siRNA), 采用Western blotting法检测各组细胞中BRD4蛋白表达水平。再将H9c2细胞随机分为对照组、TGF-β1组、si-NC+TGF-β1组和si-BRD4+TGF-β1组。对照组：细胞常规培养；TGF-β1组：20μg·L-1TGF-β1处理细胞24 h；si-NC+TGF-β1组：细胞转染阴性对照siRNA后，采用TGF-β1处理细胞24 h；si-BRD4+TGF-β1组：细胞转染BRD4特异性siRNA后，采用TGF-β1处理细胞24h。siRNA转染前24 h，接种H9c2心肌细胞于6孔板(每孔3.5×105个细胞)，细胞密度达80%~90%时进行转染，转染参照LipofectamineTM2000试剂盒说明书进行。
1.4 Western blotting法检测细胞中BRD4、Bcl-2、Bax、Cleaved caspase3、P38和p-P38蛋白表达水平各组细胞加适量细胞裂解液，冰上裂解反应30 min，离心，弃掉上清液，BCA法测定总蛋白浓度。蛋白与上样缓冲液混匀，100℃变性5 min。取40 μg蛋白上样，经10% SDS-PAGE电泳分离，电泳后电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭膜1 h，加BRD4、Bcl-2、Bax、Cleaved caspase3、P38和p-P38抗体(1:500稀释)，4℃孵育过夜，洗膜，加HRP标记的二抗(1:2000稀释)，室温孵育2 h，洗膜，ECL化学发光剂显色，Quantity One软件分析各蛋白条带灰度值。以目的蛋白与内参GAPDH灰度值比值代表各蛋白的相对表达水平。实验重复3次。
1.5 细胞增殖活性检测以1×105 mL-1细胞接种对数生长期的H9c2细胞于96孔板，每孔200 μL细胞悬液，每组设置6个复孔，于培养箱内常规培养24 h后，按照上述分组方法处理细胞，处理结束后，每孔中加入20 μL MTT溶液，培养箱内常规孵育4 h，弃掉上清液，每孔中加入150 μL DMSO溶液，震荡10 min，使结晶能够溶解充分。酶标仪测定波长490 nm处的吸光度(A)值。细胞增殖活性=(实验组A值/对照组A值)× 100%。实验重复3次。
1.6 细胞凋亡率检测细胞分组和处理方法同1.3，离心，收集细胞，PBS洗涤细胞，加1×Binding buffer重悬细胞，然后分别加入Annexin Ⅴ-FITC和PI各5 μL，于培养箱内常规孵育1 h，通过BD FACScan流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。细胞凋亡率=凋亡细胞数/(凋亡细胞数+正常细胞数)×100%。每组设置3个重复，实验重复3次。
1.7 统计学分析采用SPSS21.0统计软件进行统计学分析。各组细胞增殖活性、凋亡率及BRD4、Bcl-2、Bax、Cleaved caspase3、P38和p-P38蛋白表达水平以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，两两多重比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组细胞中BRD4蛋白表达水平Western blotting法检测BRD4特异性siRNA转染的H9c2细胞BRD4蛋白表达水平，结果见图 1。空白对照组、si-NC组和si-BRD4组H9c2细胞中BRD4蛋白表达水平分别为0.563±0.051、0.556±0.050和0.129±0.015。si-BRD4组细胞中BRD4蛋白表达水平明显低于空白对照组(P < 0.05)，si-NC组与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。
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| Lane 1:Blank control group; Lane 2:si-NC group; Lane 3:si-BRD4 group. 图 1 转染si-BRD4的H9c2细胞中BRD4蛋白表达电泳图 Fig. 1 Electrophoregram of expressions of BRD4 protein in H9c2 cells transfected with si-BRD4 |
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与对照组比较，TGF-β1组细胞增殖活性明显降低(P < 0.05)，细胞凋亡率明显升高(P < 0.05)；与TGF-β1组比较，si-BRD4+TGF-β1组细胞增殖活性明显升高，细胞凋亡率降低(P < 0.05)。见图 2和表 1。
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| A:Control group; B:TGF-β1 group; C:si-NC+TGF-β1 group; D:si-BRD4+TGF-β1 group. 图 2 流式细胞术检测各组H9c2细胞凋亡率 Fig. 2 Apoptotic rates of H9c2 cells in various groups detected by flow cytometry |
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| (n=3, x±s) | ||
| Group | Proliferation activity | Apoptotic rate (η/%) |
| Control | 0.674±0.058 | 2.34±0.21 |
| TGF-β1 | 0.351±0.037* | 33.11±2.68* |
| si-NC+TGF-β1 | 0.362±0.035 | 32.29±2.54 |
| si-BRD4+TGF-β1 | 0.551±0.049△ | 14.49±0.89△ |
| F | 35.010 | 183.524 |
| P | < 0.001 | < 0.001 |
| *P < 0.05 compared with control group; △P < 0.05 compared with TGF-β1 group. | ||
与对照组比较，TGF-β1组H9c2细胞中Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P < 0.05)，Bax和Cleaved caspase3蛋白表达水平明显升高(P < 0.05)；与TGF-β1组比较，si-BRD4+TGF-β1组H9c2细胞中Bcl-2蛋白表达水平明显升高(P < 0.05)，Bax和Cleaved caspase3蛋白表达水平明显降低(P < 0.05)。见图 3和表 2。
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| Lane1:Control group; Lane 2:TGF-β1 group; Lane 3:si-NC+TGF-β1 group; Lane 4:si-BRD4+TGF-β1 group. 图 3 各组H9c2细胞凋亡相关蛋白表达电泳图 Fig. 3 Electrophoregram of expressions of apoptosis-related proteins in H9c2 cells in various groups |
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| (n=3, x±s) | |||||
| Group | Bcl-2 | Bax | Cleaved caspase3 | P38 | p-P38 |
| Control | 0.525±0.051 | 0.104±0.012 | 0.110±0.013 | 0.665±0.061 | 0.021±0.005 |
| TGF-β1 | 0.093±0.010* | 0.321±0.032* | 0.052±0.007* | 0.652±0.060 | 0.106±0.012* |
| si-NC+TGF-β1 | 0.090±0.009 | 0.350±0.036 | 0.046±0.006 | 0.669±0.063 | 0.109±0.013 |
| si-BRD4+TGF-β1 | 0.334±0.032△ | 0.158±0.017△ | 0.096±0.010△ | 0.648±0.057 | 0.063±0.007△ |
| F | 139.342 | 63.493 | 34.260 | 0.084 | 53.507 |
| P | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | 0.967 | < 0.001 |
| * P < 0.05 compared with control group; △P < 0.05 compared with TGF-β1 group. | |||||
与对照组比较，TGF-β1组H9c2细胞中p-P38蛋白表达水平升高(P < 0.05)；与TGF-β1组比较，si-BRD4+TGF-β1组H9c2细胞中p-P38蛋白表达水平降低(P < 0.05)。各组细胞中P38蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表 2和图 4。
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| Lane 1:Control group; Lane 2:TGF-β1 group; Lane 3:si-NC+TGF-β1 group; Lane 4:si-BRD4+TGF-β1 group. 图 4 各组H9c2细胞中P38和p-P38蛋白表达电泳图 Fig. 4 Electrophoregram of expressions of P38 and p-P38 proteins in H9c2 cells in various groups |
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BRD4为溴结构域蛋白的一个主要成员，是一种特殊的染色体结合因子，与一般的核转录调节因子不同，可在有丝分裂的整个过程中始终结合到染色体上, 与乙酰化组蛋白结合，并招募其他染色体修饰蛋白，从而引起靶基因抑制或活化[7-8]。BRD4还可与乙酰化的组蛋白结合，调控基因转录、细胞周期及DNA复制等活动[9]。目前对BRD4的研究多集中于肿瘤方面，已有多项研究表明BRD4与肿瘤细胞生长有密切关联[10-11]。近年来研究[6]表明：抑制BRD4表达可降低心肌梗死模型大鼠心肌细胞凋亡率，提示BRD4与心肌细胞凋亡相关。但目前BRD4对心肌细胞的影响及其作用机制尚不完全清楚。本研究致力于探讨抑制BRD4对心肌细胞凋亡影响及其机制。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一项可阻断特定基因表达的新技术，具有稳定性强、高效性和可传递性等特点，在基因调控和基因功能研究等领域中有广泛的应用，为基因治疗开辟了新的途径[12-13]。本研究将BRD4特异性siRNA转染H9c2细胞，结果显示：BRD4蛋白表达水平明显降低，说明成功建立了抑制BRD4表达的H9c2细胞模型。
TGF-β1是一种具有诱导生长能力的多肽因子，TGF-β1及受体在心肌间质细胞、心肌细胞中均有表达，在心血管疾病发生发展过程中有重要作用[14]。有研究[15-16]表明：血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)和神经肽Y(neuropeptide Y，NPY)等一些与高血压、心肌肥厚有关的体液因素均可刺激心肌细胞TGF-β1分泌，并可通过TGF-β1引起心肌肥大，血清中TGF-β1水平与高血压水平呈正相关关系。因此TGF-β1诱导可模拟心肌细胞凋亡[17]。本研究采用TGF-β1建立心肌细胞凋亡模型，细胞增殖活性和细胞凋亡率检测结果显示：TGF-β1可明显抑制H9c2细胞增殖活性，诱导细胞凋亡，而抑制BRD4表达可减弱这一效应，提示干扰BRD4对TGF-β1引起的心肌细胞损伤有保护作用。
细胞凋亡受到分子水平的调控。Caspase是一个关键的与细胞凋亡有关的酶家族，是细胞凋亡的执行者和介导者，其激活或表达超量可导致细胞凋亡，又称为凋亡蛋白酶。Caspase3是Caspase家族成员之一，位于Caspase级联反应下游，其激活可导致细胞凋亡不可逆，被认为是引起细胞凋亡的真正实施者[18]。Bcl-2和Bax均为Bcl-2家族成员，发挥抑凋亡和促凋亡作用，Bax可与Bcl-2形成异源二聚体，提高Bax表达可拮抗Bcl-2作用，两者互作可决定细胞是否继续存活[19]。心肌细胞凋亡与Caspase3、Bcl-2、Bax表达和Bcl-2/Bax比值有密切关联[20]。本研究结果显示：抑制BRD4表达可减弱TGF-β1对Bcl-2表达的抑制及对Bax和Cleaved caspase3表达的促进作用，提示BRD4可通过调节Bcl-2及Caspase家族相关蛋白表达影响心肌细胞凋亡。
P38-丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路是体内一条重要的信号转导途径，涉及细胞生长、分化和发育等过程，与肿瘤、心血管疾病和炎症等多种疾病发生发展有密切关联[21]。P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)是MAPK家族成员之一，卢永浩等[22]研究表明：Aβ-(25~35)可通过激活P38-MAPK信号通路促进大鼠心肌细胞凋亡，提示P38-MAPK信号通路激活可促进心肌细胞凋亡。本研究结果显示：抑制BRD4表达可减弱TGF-β1对p-P38蛋白表达的上调作用，提示干扰BRD4可通过抑制P38-MAPK信号通路减弱心肌细胞损伤。
综上所述，抑制BRD4基因表达可减弱TGF-β1诱导的心肌细胞凋亡，其机制可能与抑制P38-MAPK信号通路有关。目前BRD4在心血管疾病方面研究较少，值得进一步深入探讨。
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