动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是危害人类健康的一大类疾病，20世纪60年代，欧美等发达国家AS发病率大幅增加，成为常见流行病。目前，AS已成为危害人类健康的第一位杀手，成为冠心病的主要死因^[1-2]。随着我国人民生活节奏、饮食结构和生活方式的改变，以及老龄化社会的到来，城市冠心病患者的死亡率高达34.3%，而在农村由冠心病导致的死亡率达到了22.7%^[3-6]。目前临床治疗AS的方法主要为药物治疗、介入疗法和手术治疗，但长期服用西药的不良反应较多，严重的可引起心动过缓和心律失常等^[7]。炎症反应贯穿AS发病的各个阶段，可能是多种致AS因素致病机制的共同环节或通路。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)能促进血管内皮细胞分裂。白细胞介素18(interleukin-18，IL-18)和白细胞介素10 (interleukin-10，IL-10)共同参与AS的发生发展，调整炎性细胞因子的释放，改善AS预后。小檗碱又称黄连素，现代药理学研究^[8-11]证实：小檗碱具有抗AS和调节糖脂代谢等作用。研究^[12]证实：小檗碱可以抑制AS的形成，对AS具有良好的防治作用，但其作用机制尚未明确。迄今为止，国内外对小檗碱抗AS炎症的作用机制鲜有报道。本研究通过建立AS大鼠模型，探讨小檗碱联合辛伐他汀对AS模型大鼠血清和胸主动脉组织中VEGF、TGF-β1、IL-18和IL-10表达的影响，阐述小檗碱对AS的免疫炎症机制。

清洁级SD大鼠52只，雄性，3~4周龄，体质量180~210 g，购于新疆医科大学动物中心，动物许可证号: SCXK(新)2016-0002。小檗碱(成都德思特生物技术有限公司)，辛伐他汀(海正辉瑞制药有限公司)，维生素D3(上海通用药业股份有限公司)，VEGF兔抗鼠多克隆抗体、TGF-β1兔抗鼠多克隆抗体、IL-18兔抗鼠多克隆抗体和IL-10兔抗鼠多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，DAB显色试剂盒(深圳晶美生物工程有限公司)，无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)。Neofuge 15R台式高速冷冻离心机(上海力新仪器有限公司)，Olympus光学显微镜(日本BHS公司)，DV800型全自动生化测定仪(美国Bechman公司)，YNZ-35-50液氮生物容器(上海亚荣生化仪器厂)。

随机选取8只大鼠作为对照组，给予普通饲料喂养。其余大鼠参照文献[13]建立AS模型：大鼠腹腔注射维生素D3(70万IU·kg^-1)，12 h后开始高脂饲料喂饲，10周后腹腔注射2.5 mg·kg^-1卵白蛋白致敏，每周3次，连续注射4周，随机取大鼠3只，处死，采集主动脉及心脏冠状动脉，置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h，制备病理切片置于光学显微镜下观察病变，发现AS形成，提示建模成功。40只建模成功大鼠随机分为模型组，辛伐他汀组，低、中和高剂量小檗碱联合辛伐他汀组。模型组和对照组大鼠每天灌胃生理盐水，其余4组大鼠给予辛伐他汀溶液20 mg·kg^-1·d^-1灌胃，同时低、中和高剂量小檗碱联合辛伐他汀组大鼠再给予50、100和200 mg·kg^-1·d^-1小檗碱溶液灌胃，小檗碱及辛伐他汀剂量根据文献[8]换算成大鼠用量，连续给药4周。

取材前大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，内眦静脉取血5 mL，低温离心分离血清，存放-80℃冰箱备用。处死大鼠，剖开胸腹腔，取胸主动脉组织标本，生理盐水冲洗后置于4%多聚甲醛中固定，包埋，切片。

取4%多聚甲醛固定的胸主动脉组织，常规石蜡包埋、切片及HE染色，光镜下观察胸主动脉组织的病理形态表现。

采用全自动生物化学分析仪检测各组大鼠血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平，单位为mmol·L^-1。

取血清样品，通过全自动生化检测仪采用酶法及双抗体夹心ABC-ELISA法检测各组大鼠血清中VEGF、TGF-β1、IL-18和IL-10水平，单位为μg ·L^-1。

取4%多聚甲醛固定的胸主动脉组织，常规进行脱水、石蜡包埋和切片，采用常规免疫组织化学法检测大鼠胸主动脉组织中VEGF、TGF-β1、IL-18和IL-10蛋白表达水平，步骤严格按照试剂盒说明书进行操作，利用显微镜图像软件系统采集图像，显微镜下以胸主动脉组织细胞质出现棕黄色颗粒者为阳性，采用Image-proplus分析软件统计阳性显色的平均积分光密度(IOD)值，即为阳性细胞VEGF、TF-β1、IL-18和IL-10蛋白相对表达水平。

采用SPSS18.0统计软件进行统计学分析。各组大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、VEGF、TGF-β1、IL-18、IL-10水平和胸主动脉组织中VEGF、TGF-β1、IL-18、IL-10蛋白表达水平以x ±s表示，对各组数据进行正态性检验, 符合正态分布的数据组间比较采用单因素方差分析。以P < 0.05表示差异有统计学意义。

大鼠胸主动脉组织HE染色结果显示：对照组大鼠主动脉血管壁完整光滑，无脂质沉积现象，内膜无增生，中膜平滑厚薄均匀，无斑块形成。模型组大鼠主动脉内膜明显增厚，细胞内外有脂质沉积，内膜下可见坏死物沉积，内壁出现斑块、不平整，血管腔狭窄，提示造模成功。辛伐他汀组大鼠较模型组AS明显好转，内膜增厚减少，血管内壁可见小的斑块出现，动脉仍有小的狭窄段。高剂量小檗碱联合辛伐他汀组大鼠动脉血管壁无明显斑块出现，内膜增厚不平整明显改善。见图 1(插页六)。

A: Control group; B: Model group; C: Simvastatin group; D: Low dose of berberine combined with simvastatin group; E: Middle dose of berberine combined with simvastatin group: F: High dose of berberine combined with simvastatin group. 图 1 各组大鼠胸主动脉组织病理形态表现（HE，×200） Fig. 1 Pathomorphology of thoracic aorta tissue of rats in various groups (HE, ×200)

图选项

与对照组比较，模型组大鼠血清中TC、TG和LDL-C水平均明显升高(P < 0.05或P < 0.01)，HDL-C水平明显降低(P < 0.05)。与模型组比较，辛伐他汀组和不同剂量小檗碱联合辛伐他汀组大鼠血清中TC、TG和LDL-C水平明显降低(P < 0.05或P < 0.01)，HDL-C水平明显升高(P < 0.05)，高剂量小檗碱联合辛伐他汀组大鼠上述指标变化更明显。见表 1。

与对照组比较，模型组、辛伐他汀组和不同剂量小檗碱联合辛伐他汀组大鼠血清中VEGF、TGF-β1、IL-18和IL-10水平明显升高(P < 0.05)；与模型组比较，辛伐他汀组及不同剂量小檗碱联合辛伐他汀组大鼠血清中VEGF和IL-18水平明显降低(P < 0.05或P < 0.01)，TGF-β1和IL-10水平明显升高(P < 0.05)。见表 2。

大鼠胸主动脉组织中VEGF、TGF-β1、IL-18和IL-10均有阳性表达，主要表达于动脉内皮细胞胞浆，阳性染色为棕黄色。对照组大鼠VEGF、TGF-β1、IL-18、IL-10少量表达于血管。与对照组比较，模型组大鼠胸主动脉组织中VEGF和IL-18蛋白表达水平明显升高(P < 0.01)，TGF-β1和IL-10蛋白表达水平明显降低(P < 0.05)；与模型组比较，辛伐他汀组大鼠胸主动脉组织中IL-18蛋白表达水平明显降低(P < 0.05)，TGF-β1蛋白表达水平明显升高(P < 0.05)，不同剂量小檗碱联合辛伐他汀组大鼠胸主动脉组织中VEGF和IL-18表达水平均明显降低(P < 0.05或P < 0.01)，TGF-β1和IL-10表达水平明显升高(P < 0.05)。见表 3和图 2(插页七)。

A-F: VEGF; G-L: TGF-B1; M-R: IL-18; S-X: IL-10; A, G, M, S: Control group; B, H, N, T: Model group; C, I, O, U: Simvastatin group; D, , P, V: Low dose of berberine combined with simvastatin group; E, K, Q, w: Middle dose of berberine combined with simvastatin group; F, L, R, X: High dose of berberine combined with simvastatin group. 图 2 各组大鼠胸主动脉组织免疫组织化学染色结果（×400） Fig. 2 Immunohistochemistry staining results of thoracic aorta tissue of rats in various groups(×400)

图选项

研究^[14-15]显示：炎症因子介导的血管壁慢性炎症反应、血管内皮受损及其通透性、黏附性和血管再生等功能紊乱，是AS发生发展的重要机制。当损伤因素长期存在时，会产生大量炎症因子和细胞因子，进而引起大量细胞凋亡，最终导致粥样斑块的形成。因此，炎症反应是AS斑块脂质中心形成的重要因素之一。VEGF是一种作用于血管内皮细胞高度特异性的有丝分裂原，对维持正常血管内皮细胞功能以及修复受损内皮起重要的作用^[16]。AS发生时，缺血缺氧的组织诱发多种细胞分泌VEGF，促使内皮细胞分裂、增殖，并促进炎性细胞在血管壁的黏附，促进新生血管在动脉粥样斑块中形成，进而加重AS^[17]。TGF-β1属于细胞生长增殖调节蛋白，参与细胞功能的调节^[18]。研究^[19]表明：TGF-β1在动脉内皮的损伤、炎性细胞浸润、动脉壁脂质聚集以及细胞外基质的沉积等引起AS的过程中均发挥重要作用。也有研究^[20]显示：TGF-β1可诱导内皮细胞产生前列环素，防止血小板聚集及血栓形成，发挥强大的非特异性抗炎作用，延缓AS的形成。本研究结果显示：模型组大鼠血清中VEGF水平和胸主动脉组织中VEGF蛋白表达水平增加，TGF-β1水平降低，证明AS模型大鼠炎症因子变化符合血管受损时的机体应激状态。血清IL-18是较强的致AS细胞因子，具有前炎症因子活性，参与斑块形成，增加斑块面积^[21]。IL-10是一种多效细胞免疫因子，能抑制炎症因子的释放和产生，同时抑制细胞增生，具有非常强的免疫抑制和抗炎作用^[22]。研究^[23]显示：IL-18/IL-10代表机体炎性的动态平衡状态，是观察AS斑块稳定性的重要指标。血脂代谢异常是AS发病的重要因素，与AS的发生发展有着密切的关系，能够反映AS的病变水平。本实验证明：模型组大鼠IL-18和IL-10水平的变化符合AS发病时IL-18和IL-10水平变化的规律。

小檗碱联合辛伐他汀在临床上可用于治疗脑梗死和调节血脂，但是对于其联合应用的作用机制尚不明确。本实验中的HE染色结果显示：辛伐他汀组大鼠AS较模型组明显好转，内膜增厚减少，血管内壁可见小的斑块出现，动脉仍有小的狭窄段，而高剂量小檗碱联合辛伐他组大鼠胸主动脉血管壁无明显斑块出现，内膜增厚不平整明显改善，表明小檗碱联合辛伐他汀可明显抑制AS斑块的形成，对辛伐他汀改善内皮血管的修复功能具有一定的增效作用，采用中西药结合的方法对于大鼠可以达到标本兼顾的治疗作用。本研究结果显示：辛伐他汀组和不同剂量小檗碱联合辛伐他汀组大鼠血清中TC、TG和LDL-C水平明显降低，同时HDL-C明显升高，提示小檗碱具有明显的降脂作用，HDL-C水平提高有利于外周组织清除胆固醇，从而防止AS的形成，结合组织病理学形态观察，提示小檗碱能够通过调节脂质代谢，抑制AS斑块的形成；同时，与模型组比较，不同剂量小檗碱联合辛伐他汀组大鼠血清和胸主动脉组织中VEGF、TGF-β1、IL-18和IL-10水平和蛋白表达水平均有明显的改变，提示小檗碱联合辛伐他汀可能是通过下调VEGF和IL-18水平、上调TGF-β1和IL-10水平，发挥治疗AS的作用。

综上所述，VEGF、TGF-β1、IL-18和IL-10可能成为免疫调节治疗AS的新部位和新靶点，因此寻找能直接抑制VEGF、IL-18活性，同时提升TGF-β1和IL-10水平的基因药物是生物医药科研领域一个重要的研究方向。