2019, Vol. 45扩展功能
文章信息
- 褚金龙, 邢桂芝, 沈春瑾, 刘鑫颖, 褚智君
- CHU Jinlong, XING Guizhi, SHEN Chunjin, LIU Xinying, CHU Zhijun
- 三七总皂苷对再生障碍性贫血小鼠T淋巴细胞亚群的影响及其促造血作用
- Influence of panax notoginseng saponins in T lymphocyte subsets in aplastic anemia mice and its hematopoietic effect
- 吉林大学学报(医学版), 2019, 45(04): 807-812
- Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2019, 45(04): 807-812
- 10.13481/j.1671-587x.20190411
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文章历史
- 收稿日期: 2018-10-26
2. 河北医科大学附属唐山工人医院检验科, 河北 唐山 063000;
3. 华北理工大学附属医院药剂科, 河北 唐山 063000;
4. 河北医科大学附属唐山工人医院药剂科, 河北 唐山 063000
2. Department of Laboratory, Affiliated Tangshan Workers'Hospital, Hebei Medical University, Tangshan 063000, China;
3. Department of Pharmacy, Affiliated Hospital, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China;
4. Department of Pharmacy, Affiliated Tangshan Workers'Hospital, Hebei Medical University, Tangshan 063000, China
再生障碍性贫血是一种由机体免疫异常引起骨髓造血功能损伤的综合征，主要表现为血细胞减少。研究[1]表明：机体免疫异常是再生障碍性贫血主要发病机制。T淋巴细胞为机体细胞免疫的效应细胞，可通过分泌造血负调控因子降低再生障碍性贫血患者的造血功能。T淋巴细胞亚群的表达水平与再生障碍性贫血的发生有密切关联[2]。目前临床上对再生障碍性贫血的常规治疗方法主要为免疫抑制治疗，但是该治疗方法不良反应多、疗程长，因此寻求能够有效调节免疫、促进造血的治疗方法一直是再生障碍性贫血临床治疗的关注点。三七总皂苷(panax notoginseng saponins, PNS)是中药三七[panax notoginseng (Burk) F. H. chen]的主要活性成分，可调节免疫系统功能，促进造血干细胞增殖，进而增强造血功能[3-6]。为探讨PNS对再生障碍性贫血的治疗作用及其相关机制，本文作者通过建立再生障碍性贫血小鼠模型，观察PNS对小鼠细胞免疫系统和造血功能的作用，为再生障碍性贫血的临床治疗和PNS的应用提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 动物、主要试剂和仪器8周龄SPF级BALB /C小鼠50只，雄性，体质量18~22 g。8~14周龄SPF级DBA/2小鼠(H-2a，MLSa)6只，雄性，体质量18~22 g，作为细胞供体。小鼠均购自中科院上海实验动物中心，动物合格证号SCXK(沪)2007-0005。PNS(云南三圣药业有限公司)，抗小鼠CD4-FITC和CD8-PE单克隆抗体(美国BD Pharmingen公司)，γ干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α) ELISA检测试剂盒(美国Ray Biotech公司)。BC-2600全自动血细胞分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)，BD FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)，离心机(上海医用分析仪器厂)。
1.2 动物分组和模型制备[7]取DBA/2小鼠，采用断头法处死，无菌条件下取出颈部、胸腺、腹股沟和肠系膜处淋巴结，于生理盐水中浸泡，清洗血迹及结缔组织，碾碎，过滤(200目)，制成单细胞悬液(浓度为5×106 mL-1，胸腺细胞:淋巴细胞=1:2)，采用台盼蓝测定细胞活性(活性>95%)。取BALB /C小鼠40只随机分为模型组和低、中、高剂量PNS组，经60Co γ射线全身5.0 Gy(1.0 Gy·min-1，5min)照射后，2h内尾静脉注射上述制得的单细胞悬液0.2 mL(细胞数为1×106个/只)。另取BALB /C小鼠10只作对照组，用铅屏蔽进行假照射后，2h内尾静脉注射生理盐水0.2 mL。于造模结束后第1天开始给药。低、中、高剂量PNS组小鼠分别腹腔注射100、200和400 mg·kg-1 PNS，连续给药14 d。对照组和模型组小鼠腹腔注射给予生理盐水0.2 mL·d-1。
1.3 小鼠外周血T淋巴细胞亚群检测14 d后取小鼠眼球取血，肝素抗凝，备用。取肝素抗凝血，分别加入CD4-FITC、CD8-PE单克隆抗体10 μL，4℃下避光孵育30 min，加入溶血剂溶解红细胞，用PBS缓冲液洗涤游离抗体后，采用流式细胞仪检测CD4+和CD8+，用百分率表示。
1.4 小鼠外周血细胞计数和血红蛋白(Hb)水平检测另取小鼠肝素抗凝血20 μL，采用全自动血细胞分析仪检测外周血中红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血小板(Plt)数量和Hb水平。
1.5 小鼠骨髓单个核细胞(BMCs)数量检测处死小鼠，取右侧股骨，采用不含血清的IMDM培养液冲洗，得到骨髓细胞，1000 r·min-1离心10 min，弃去上清液，加入1mL IMDM培养液，混匀，制成骨髓细胞混悬液，取20 μL细胞混悬液加入红细胞裂解液后，在显微镜下计算骨髓中BMCs数量。
1.6 小鼠血清中INF-γ和TNF-α水平测定小鼠摘眼球取血，于常温放置15min后，3000 r·min-1离心10 min，收集血清，采用IFN-γ和TNF-α ELISA检测试剂盒检测小鼠血清中IFN-γ和TNF-α水平，通过吸光度-浓度曲线计算质量浓度，单位ng·L-1。
1.7 小鼠脏器指数测定处死小鼠后，称取小鼠体质量及脾脏和胸腺质量，计算脏器指数(脾脏指数及胸腺指数)，脏器指数=脏器质量(mg)/体质量(g)。
1.8 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。各组小鼠体质量，脾脏及胸腺指数，外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞百分率，CD4+/CD8+T淋巴细胞比值，外周血中RBC、BMCs、WBC、Plt数量和Hb水平，血清中INF-γ和TNF-α水平，均以x±s表示，采用Kolmogorov-Smirnov检验分析数据是否符合正态分布，符合正态分布的数据组间比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组小鼠一般情况各组小鼠均无死亡，与对照组比较，模型组小鼠体质量降低，毛色、食欲和精神状态较差，活动少。PNS干预5d后，高剂量PNS组小鼠活动增加，食欲有改善；PNS干预6 d后，低和中剂量PNS组小鼠活动开始增加，食欲有改善。
2.2 各组小鼠外周血T淋巴细胞亚群百分率与对照组比较，模型组小鼠外周血CD4+T淋巴细胞百分率和CD4+/CD8+T淋巴细胞比值明显降低(P < 0.05)，CD8+T淋巴细胞百分率明显升高(P < 0.05)；与模型组比较，低、中和高剂量PNS组小鼠外周血CD4+T淋巴细胞百分率和CD4+/ CD8+T淋巴细胞比值明显升高(P < 0.05)，CD8+T淋巴细胞百分率明显降低(P < 0.05)。见表 1和图 1。
| (n=10, x±s) | ||||
| Group | Dose(mg·kg-1) | CD4+(η/%) | CD8+(η/%) | CD4+ /CD8+ |
| Control | 0 | 33.76±5.67 | 15.46±1.72 | 2.18±0.36 |
| Model | 0 | 25.47±3.44* | 22.36±4.21* | 1.14±0.29* |
| PNS | ||||
| Low dose | 100 | 28.05±4.52△ | 20.45±2.20△ | 1.38±0.46△ |
| Medium dose | 200 | 31.29±4.55△ | 19.04±3.65△ | 1.64±0.48△ |
| High dose | 400 | 32.98±3.80△ | 16.05±1.34△ | 2.05±0.53△ |
| * P < 0.05 compared with control group; △ P < 0.05 compared with model group. | ||||
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| A: Control group; B: Model group; C: Low dose of PNS group; D:Medium dose of PNS group; E: High dose of PNS group. 图 1 流式细胞术检测各组小鼠外周血T淋巴细胞亚群百分率 Fig. 1 Percentages of Tlymphocyte subsets of mice in various groups detected by flow cytometry |
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与对照组比较，模型组小鼠外周血中RBC、BMCs、WBC、Plt数量及Hb水平明显降低(P < 0.05)；与模型组比较，低、中和高剂量PNS组小鼠外周血中RBC、BMCs、WBC、Plt数量及Hb水平水平明显升高(P < 0.05)。不同剂量PNS组小鼠外周血中RBC、BMCs、WBC、Plt数量及Hb水平随给药剂量增加而升高，且不同剂量PNS组间比较差异有统计学意义(P < 0.05)，具有一定剂量依赖性。见表 2。
| (n=10, x±s) | ||||||
| Group | Dose(mg·kg-1) | RBC(×104 mm-3) | BMCs(×109 L-1) | WBC(×109 L-1) | Plt(×109 L-1) | Hb[ρB/(g·L-1)] |
| Control | 0 | 630.98±80.09 | 17.50±2.80 | 5.94±1.06 | 592.98±72.55 | 152.96±8.36 |
| Model | 0 | 320.22±56.32* | 4.28±1.94* | 0.83±0.26* | 116.37±21.26* | 94.09±7.52* |
| PNS | ||||||
| Low dose | 100 | 450.35±76.88△ | 7.30±2.11△ | 2.94±0.62△ | 476.47±52.77△ | 115.24±10.06△ |
| Medium dose | 200 | 520.24±89.44△# | 11.02±3.04△# | 4.28±0.75△# | 504.37±70.45△# | 136.96±6.47△# |
| High dose | 400 | 626.37±90.46△#○ | 12.56±2.17△#○ | 5.82±0.95△#○ | 553.99±65.93△#○ | 143.80±8.95△#○ |
| * P < 0.05 compared with control group; △ P < 0.05 compared with model group；# P < 0.05 compared with low dose of PNS group；○P < 0.05 compared with medium dose of PNS group. | ||||||
与对照组比较，模型组小鼠血清中IFN-γ和TNF-α水平明显升高(P < 0.05)；与模型组比较，低、中和高剂量PNS组小鼠血清中IFN-γ和TNF-α水平明显降低(P < 0.05)。低、中和高剂量PNS组小鼠血清中IFN-γ和TNF-α水平随着给药剂量增加而降低，但不同剂量组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表 3。
| [n=10, x±s, ρB/(ng·L-1)] | |||
| Group | Dose(mg·kg-1) | IFN-γ | TNF-α |
| Control | 0 | 249.87±33.77 | 324.86±78.03 |
| Model | 0 | 370.23±74.20* | 583.11±92.48* |
| PNS | |||
| Low dose | 100 | 310.52±42.58△ | 450.72±112.95△ |
| Medium dose | 200 | 278.48±52.80△ | 382.85±96.34△ |
| High dose | 400 | 255.09±36.75△ | 332.85±56.37△ |
| * P < 0.05 compared with control group; △P < 0.05 compared with model group. | |||
与对照组比较，模型组小鼠体质量、脾脏及胸腺指数明显降低(P < 0.05)；与模型组比较，低、中、高剂量PNS组小鼠体质量、脾脏及胸腺指数明显增加(P < 0.05)。见表 4。
| (n=10, x±s) | ||||
| Group | Dose(mg·kg-1) | Body weight (m/g) | Spleen index | Thymus index |
| Control | 0 | 26.32±3.57 | 4.90±0.32 | 0.31±0.04 |
| Model | 0 | 21.20±3.86* | 2.87±0.30* | 0.17±0.03* |
| PNS | ||||
| Low dose | 100 | 23.59±3.17△ | 3.26±0.45△ | 0.22±0.05△ |
| Medium dose | 200 | 24.20±3.26△ | 3.80±0.37△ | 0.24±0.05△ |
| High dose | 400 | 24.22±4.01△ | 3.96±0.47△ | 0.25±0.04△ |
| * P < 0.05 compared with control group; △P < 0.05 compared with model group. | ||||
再生障碍性贫血是一种由于外界因素导致机体骨髓造血能力下降、全血细胞数量减少的疾病。研究[8]表明：造血微环境受到损伤、造血干细胞发生内在缺陷及细胞免疫机制异常是发生再生障碍性贫血的主要发病机制，其中细胞免疫异常是其发病机制中的重要环节。
T淋巴细胞作为细胞免疫的效应细胞，主要包括辅助性T淋巴细胞(CD4+T淋巴细胞)和抑制性T细胞(CD8+T淋巴细胞)等，其亚群水平变化在再生障碍性贫血的发病中起重要的作用。T淋巴细胞中的CD8+T淋巴细胞通过激活细胞毒T淋巴细胞，抑制干/祖细胞的增殖，降低其分化成各种血细胞前体细胞的能力，并促进IFN-γ和TNF-α等造血负调控因子的释放[9-10]。IFN-γ水平升高可引起CD4+T细胞凋亡，并且阻滞造血干细胞增殖周期进程，抑制部分造血细胞如粒-巨噬系祖细胞、红系造血祖细胞的形成[11-12]。TNF-α水平升高刺激CD4+T淋巴细胞过度表达从而诱导其凋亡，并阻止造血细胞进入增殖周期，抑制机体造血功能[13]。此外，IFN-γ与TNF-α能够产生协同作用，使其抑制效应增强，因此外周血中IFN-γ和TNF-α水平升高也是导致再生障碍性贫血患者造血功能衰减的原因之一。机体的造血功能主要通过RBC、WBC、Plt和Hb等血液学参数直观反映。WBC能对抗原发生应答，吞噬入侵的外来物，WBC数量减少，使机体抗感染能力受损；Plt的主要功能是凝血、止血和修补破损血管；Hb是RBC内运输氧的特殊蛋白质。WBC、Plt和Hb数量变化通常作为再生障碍性贫血造血功能损伤程度的重要参考指标。
再生障碍性贫血在中医学中，属于“血症”范畴，主要由肾虚、邪毒等因素引起气血的化生和运行失调，导致精亏血弱，血脉瘀阻。中医临床广泛使用活血化瘀药改善骨髓微环境，加速新陈代谢，改善血液流变学异常，调整体内正气，以提高机体的细胞免疫功能，从而促进造血干细胞的生长，使造血组织容量增加[14-16]。三七的功效为散瘀止血、消肿定痛，具有止血补血、抗血栓、增强免疫的药理作用。研究[17-19]表明：PNS能够升高白细胞，改善再生障碍性贫血的骨髓抑制，促进造血祖细胞增殖。此外，PNS还能改善造血微循环，保护造血干细胞，刺激造血因子分化。本研究结果表明：PNS能够增加再生障碍性贫血模型小鼠体质量、脾脏指数和胸腺指数，升高外周血CD4+T细胞百分率，降低CD8+T细胞百分率，恢复CD4+/CD8+T淋巴细胞比例平衡，明显降低血清中造血负调控因子IFN-γ和TNF-α水平，从而恢复细胞免疫平衡，调节机体免疫紊乱，与文献[20-21]报道结果一致；PNS同时能提高再生障碍性贫血模型小鼠外周血WBC和Plt数，增加Hb水平，促进BMCs的恢复，通过促进血细胞增殖分化，修复骨髓造血功能，从而恢复造血能力。
综上所述，PNS能够调节T淋巴细胞亚群平衡，降低细胞因子水平，调节免疫系统紊乱，恢复造血细胞增殖能力及其造血功能。上述作用是PNS改善再生障碍性贫血的重要机制。
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