2019, Vol. 45扩展功能
文章信息
- 信瑞, 李冬, 徐慧英, 王春宇, 曲丹华, 孙海峰
- XIN Rui, LI Dong, XU Huiying, WANG Chunyu, QU Danhua, SUN Haifeng
- miRNA-21对乳腺癌细胞放射敏感性的影响及其机制
- Influence of miRNA-21 in radiosensitivity of breast cancer cells and its mechanism
- 吉林大学学报(医学版), 2019, 45(04): 772-778
- Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2019, 45(04): 772-778
- 10.13481/j.1671-587x.20190405
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文章历史
- 收稿日期: 2018-12-04
2. 吉林大学第二医院妇产科, 吉林 长春 130041;
3. 吉林大学第一医院联合超声科, 吉林 长春 130021;
4. 吉林大学第二医院放疗科, 吉林 长春 130041;
5. 吉林大学第二医院呼吸与危重症医学科, 吉林 长春 130041
2. Department of Obstetrics and Gynecology, Second Hospital, Jilin University, Changchun 130041, China;
3. Department of Ultrasonography, First Hospital, Jilin University, Changchun 130021, China;
4. Department of Radiotherapy, Second Hospital, Jilin University, Changchun 130041, China;
5. Department of Respiration and Critical Disease, Second Hospital, Jilin University, Changchun 130041, China
放射治疗是乳腺癌标准治疗方式之一，据统计，70%~80%乳腺癌患者需要术后放疗[1]。治疗早期，乳腺癌细胞对放射治疗比较敏感，但随着疗程的增加，其放射抵抗逐渐明显[2]。乳腺癌放射抗性产生是影响放疗疗效和肿瘤复发的重要因素，目前其产生的机制尚未阐明。近年来研究[3]表明：miRNA与肿瘤的形成、肿瘤细胞的增殖和治疗均有着密切的联系。乳腺癌miRNA表达也存在异常，已有研究[3]显示：miRNA-21、miRNA-16和miRNA-141等在乳腺癌组织中呈异常高表达。miRNA-21是一种具有致癌作用的miRNA，在乳腺癌[4]、胶质瘤、胆管癌[5]和鼻咽癌[6]等多种肿瘤中均存在高表达。研究[4-6]显示：miRNA-21与鼻咽癌等恶性肿瘤的放疗耐药有关。另有研究[7]表明：miRNA-21表达与乳腺癌的分化、转移、分期和患者生存率有密切关联。多种miRNA在肿瘤细胞中存在差异表达，能参与调节细胞周期和凋亡，以此改变肿瘤细胞的放射敏感性[8]，但miRNA-21与乳腺癌细胞的生长和放射治疗的关联性目前尚无相关报道。鉴于miRNA-21在乳腺癌中高表达，本研究旨在分析miRNA-21与乳腺癌辐射敏感性的关系，并初步探讨其分子机制，以期为乳腺癌的放射增敏提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 细胞株、组织标本和主要试剂人乳腺癌T47D和MDA-MB-361细胞株购自美国模式培养物集存库。正常乳腺组织取自吉林大学第二医院病理室保存的手术标本。DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司，青霉素和链霉素购自美国Hyclone公司，anti-miRNA-21反义寡核苷酸和阴性对照反义寡核苷酸由上海生工公司合成，lipofectamine TM 2000试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，CCK8试剂盒和PI染液购自上海碧云天生物技术研究所，焦碳酸二乙酯(DEPC水)、RNA分离试剂和实时定量PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。
1.2 细胞培养和转染T47D和MDA-MB-361细胞培养于37℃、5% CO2和100%饱和湿度的CO2培养箱中，培养基为含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1链霉素的DMEM培养基。每隔2 ~ 3 d换液1次，毎天均使用倒置显微镜观察细胞, 记录细胞数量和状态等指标。
anti-miRNA-21反义寡核苷酸和阴性对照反义寡核苷酸由上海生工公司合成，anti-miRNA-21序列为5′-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3′, 阴性对照序列为5′-CAGUACUUUUGUGU AGUACAA-3′。取对数生长期T47D和MDA-MB-361细胞，分为空白对照组(不转染细胞)、阴性对照组(转染阴性对照序列的细胞)和anti-miRNA-21组(转染anti-miRNA-21序列的细胞)，以每孔5.0×105个细胞接种于6孔板中，在37℃、CO2细胞培养箱中孵育24 h，按lipofeetamineTM2000说明书进行转染，最佳转染条件为20 pmol·L-1 NC-FAM oligo:1 μL LipofactamineTM 2000。
1.3 照射方法GC3000 Elan辐射器(MDS Nordion, 加拿大)，γ射线，放射源为137Cs，活度为50.7E+12 Bq，源皮距为100 cm。
1.4 CCK8实验检测细胞存活率T47D和MDA-MB-361细胞分别分为0.0、2.5和5.0 Gy γ射线照射组；收集对数期细胞，96孔板中每孔加入100 μL，使待测细胞密度调至每孔5000个，置于37℃、CO2细胞培养箱中孵育24 h。协同γ射线辐射处理细胞(0.0、2.5和5.0 Gy)，设3个复孔，37℃、CO2细胞培养箱中孵育24 ~ 72 h，倒置显微镜下观察细胞形态。每孔加入20 μL CCK8试剂，避光培养4 h。使用酶标仪测定450 nm波长处各孔的吸光度(A)值。对照组细胞存活率设为100%，实验组细胞存活率=实验组A值/对照组A值×100%。
1.5 流式细胞术检测不同周期细胞百分率T47D和MDA-MB-361细胞分别分为0.0、2.5和5.0 Gy γ射线照射组；收集对数生长期细胞接种于6孔板中，经0.0、2.5和5.0 Gy γ射线处理并连续培养24 h后，收集细胞并调整细胞悬液数至约1 ×106mL-1, 收集培养细胞，加入0.5 g·L-1 RNase 50 μL, 混匀，37℃水浴30 min，PBS缓冲液洗去RNase，100 μL PBS缓冲液重悬，再加入0.05 g·L-1 PI染液4℃避光染色5 min，采用流式细胞仪检测，并采用CellQμest3.0软件进行细胞周期DNA含量分析，计算不同细胞周期细胞百分率。
1.6 实时定量PCRmiRNA-21引物由上海生工公司合成，上游引物为5′-CAAG TGTGGGCTGCTGAGGA-3′，下游引物为5′-AGCCTGGGTACAGGTTGTTGATG-3′。非照射条件下miRNA-21水平检测分为正常乳腺组织、T47D细胞和MDA-MB-361细胞组，照射条件下T47D和MDA-MB-361细胞分别分为0.0和5.0 Gy γ射线照射组(检测时间0~72 h)。
用RNA分离试剂抽提正常乳腺组织和细胞中总RNA，取5 μg RNA用Promega MMLV逆转录酶试剂进行逆转录反应，反应体系为20 μL，取0.5 μL RT产物进行实时定量PCR反应。反应条件：10 μL SYBR Green Mix (2 ×)，0.4 μL ROX Reference Dye Ⅱ，1 μL Primer1 (5 μmol·L-1)，1 μL Primer2 (5 μmol·L-1)，0.5 μL模板cDNA，7.1 μL DEPC水。荧光定量PCR扩增条件的设置：94℃、4 min，94℃、30 s，50℃、30 s，72℃、40 s，40个循环。以空白对照组组织或细胞中mRNA表达水平为1，计算实验组组织或细胞中mRNA表达水平。
1.7 miRNA-21转染后各组细胞放射抗性和不同周期细胞百分率检测miRNA-21转染后，T47D和MDA-MB-361细胞分别分为空白对照组、阴性对照组和anti-miRNA-21组，γ照射剂量为0.0、2.5和5.0 Gy，采用1.3和1.6中的方法检测各组细胞存活率和miRNA-21表达水平，即细胞的放射抗性；T47D细胞分为空白对照组、阴性对照组和anti-miRNA-21组，γ照射剂量为0.0和5.0 Gy，采用1.5中的方法检测各组细胞不同周期细胞百分率。
1.8 统计学分析采用SPSS 15.0统计软件进行统计学分析，采用Origin 8.0软件绘图。各组细胞存活率、不同细胞周期细胞百分率和miRNA-21表达水平均以x±s表示，计量资料符合正态分布，2组间样本均数比较采用t检验。以P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 γ射线照射后各组T47D和MDA-MB-361细胞存活率T47D和MDA-MB-361细胞经0.0、2.5和5.0 Gy γ射线照射后，继续培养72 h，采用CCK8法检测细胞存活率。与0.0 Gy照射组比较，5.0 Gy照射组T47D和MDA-MB-361组细胞存活率均明显降低(P < 0.05或P < 0.01)。5.0 Gy照射组T47D细胞存活率明显高于MDA-MB-361细胞(t=6.521, P=0.003)，提示T47D细胞具有更强放射抗性。见表 1。
| (n=3, x±s, η/%) | ||
| Group | Survival rate | |
| T47D cells | MDA-MB-361 cells | |
| 0.0 Gyradiation | 100.0±3.9 | 100.0±2.8 |
| 2.5 Gyradiation | 92.2±2.9 | 74.0±3.6* |
| 5.0 Gy radiation | 81.2±4.1*△ | 39.4±2.6** |
| * P < 0.05，* * P < 0.01 compared with 0.0 Gy radiation group; △ P < 0.01 compared with MDA-MB-361 cells. | ||
T47D和MDA-MB-361细胞经过0.0、2.5和5.0 Gy γ射线照射后，继续培养24 h，采用流式细胞仪分析细胞周期分布。与0.0 Gy照射组比较，2.5和5.0 Gy组T47D和MDA-MB-361细胞G2/M期细胞百分率明显升高(P < 0.05或P < 0.01)，G1/S期细胞百分率明显降低(P < 0.05或P < 0.01)。经5.0 Gyγ射线照射后，T47D细胞G2/M期细胞百分率明显低于MDA-MB-361细胞(P < 0.05)，提示T47D细胞的放射抗性与细胞周期有关。见图 1和表 2。
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| A-C:T47D cells; D-F:MDA-MB-361 cells; A, D:0.0 Gyradiation group; B, E:2.5 Gy radiation group; C, F:5.0 Gy radiation group. 图 1 流式细胞术检测γ射线照射后各组T47D和MDA-MB-361细胞不同细胞周期细胞百分率 Fig. 1 Percentages of T47D and MDA-MB-361 cells at different cell cycles in various groups detected by flow cytomertry after γ-ray radiation |
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| (n=3, x±s, η/%) | |||||||
| Group | Percentage of T47D cells | Percentage of MDA-MB-361 cells | |||||
| G1/S | G2/M | SubG1 | G1/S | G2/M | SubG1 | ||
| 0.0Gyradiation | 60.8±5.3 | 33.6±3.7 | 5.6±1.2 | 57.2±4.8 | 35.0±2.39 | 7.8±0.9 | |
| 2.5 Gyradiation | 46.7±4.7*△ | 44.6±5.8* | 8.7±0.9△ | 37.9±5.2* | 47.6±5.1* | 14.5±2.1* | |
| 5.0 Gyradiation | 29.5±6.3**△△ | 61.7±5.7**△ | 8.8±1.4*△△ | 14.0±3.2** | 68.8±8.4** | 17.2±2.0** | |
| * P < 0.05, * * P < 0.01 compared with 0.0 Gy radiation group; △ P < 0.05, △△ P < 0.01 compared with MDA-MB-361 cells. | |||||||
与正常乳腺组织比较，T47D和MDA-MB-361细胞中miRNA-21表达水平升高，其中T47D细胞miRNA-21表达水平最高，是MDA-MB-361细胞的5倍(t=14.214, P < 0.001)，提示乳腺癌辐射抗性与miRNA-21有关。当给予2种细胞5.0 Gy γ射线照射后，连续培养72 h，T27D和MDA-MB-361细胞在8 h前均表现出明显的miRNA-21表达上调，而在8 h后均逐渐回落；其中，8 h时T27D细胞miRNA-21水平是0 h时的3.7倍(t=10.015, P=0.001)，MDA-MB-361细胞miRNA-21表达水平是0 h时的1.9倍(t=4.069, P=0.017)。见图 2。
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| 图 2 γ射线照射后不同时间乳腺癌T47D和MDA-MB-361细胞中miRNA-21表达水平 Fig. 2 Expression levels of miRNA-21in T47D and MDA-MB-361 cells at different time afterγ-ray radiation |
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与空白对照组比较，anti-miRNA-21组T47D和MDA-MB-361细胞中miRNA-21表达水平明显降低(t=3.962, P=0.016; t=5.840, P=0.005)，而阴性对照组与空白对照组间比较差异无统计学意义(P>0.05)(图 3A)。0.0 Gy γ射线照射后继续培养72 h，与空白对照组(0.0 Gy γ射线照射)比较，anti-miRNA-21组2种细胞存活率均明显降低(t=5.625, P=0.006; t=5.848, P=0.005)；5.0 Gy γ射线照射后继续培养72 h，与空白对照组(5.0 Gy γ射线照射)比较，anti-miRNA-21组2种细胞存活率进一步降低(t=3.387, P=0.019;t=5.794, P=0.005)，且明显低于0.0 Gy照射时的空白对照组(t=5.479, P=0.006; t=17.374, P < 0.01)；阴性对照组与空白对照组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见图 3B和C。
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| *P < 0.05, * *P < 0.01 compared with blank control group; A: Expression levels of miRNA-21 in T47D and MDA-MB-361 cells after transfection; B, C: Survival rates of T47D and MDA-MB-361 cells after transfection. 图 3 各组T47D和MDA-MB-361细胞中miR-21表达水平和细胞存活率 Fig. 3 Expression levels of miRNA-21 in T47D and MDA-MB-361 cells and survival rates of cells in various groups |
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与照射前比较，给予5.0 Gy γ射线照射后，空白对照组细胞G2/M期细胞百分率明显升高(t=4.628, P=0.009)。5.0Gy射线照射前，与空白对照组比较，anti-miRNA-21组G2/M期细胞百分率差异无统计学意义(P>0.05)，subG1期细胞百分率明显升高(t=3.416, P=0.021)；给予5.0 Gyγ射线照射后，与空白对照组比较，anti-miRNA-21组G2/M期细胞百分率明显降低(t=6.883, P=0.003)，subG1期细胞百分率明显升高(t=6.025, P=0.004)。见图 4和表 3。
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| A, B:Blank control group; C, D:Negative control group; E, F: Anti-miRNA-21 group; A, C, E: Before radiation; B, D, F:After γ-ray 5.0 Gy. 图 4 流式细胞术检测5.0 Gy γ射线照射前后各组不同细胞周期T47D细胞百分率 Fig. 4 Percentages of T47D cells at different cell cycles in various groups before and after 5.0 Gy γ-ray radiation detected by flow cytometry |
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| Group | G1/S | G2/M | SubG1 |
| Blank control | |||
| Before radiation | 57.6±5.1 | 36.6±2.7 | 5.8±0.8 |
| After radiation | 29.2±2.6 | 64.0±5.6* | 6.8±2.0 |
| Negative control | |||
| Before radiation | 59.8±6.5 | 29.6±4.1 | 10.6±2.1 |
| After radiation | 30.9±4.0 | 61.5±5.7 | 7.6±1.8 |
| Anti-miRNA-21 | |||
| Before radiation | 60.5±7.2 | 22.8±3.6 | 16.7±3.2△ |
| After radiation | 54.0±6.2** | 18.6±2.9△△ | 27.4±4.1△△ |
| * P < 0.05, * * P < 0.01 vs before radiation; △ P < 0.05, △△ P < 0.01 vs blank control group. | |||
miRNA是一类由18 ~ 25个核苷酸组成的非编码内源性RNA分子，在果蝇、线虫、小鼠及人类等真核生物细胞中广泛存在[9-11]。miRNA通过碱基互补配对的方式与靶基因结合，导致靶基因降解，在机体发育、细胞增殖、代谢、凋亡、衰老和肿瘤发生发展等多种生物学过程中发挥调控作用。目前，经实验研究确认的miRNA共有234个，超过半数的miRNA定位于肿瘤发生相关的染色质区域，miRNA-21是一种具有致癌作用的miRNA[10]。最初在恶性胶质瘤[4]中发现miRNA-21的高表达，随后的研究[3]也显示其在乳腺癌中的高表达。MARTIN等[11]采用实时定量PCR检测了369例乳腺癌患者的乳腺癌组织的miRNA-21表达发现：乳腺癌组织中miRNA-21表达水平明显高于正常乳腺组织，且miRNA-21的高表达与乳腺癌患者肿瘤分级、不良预后和生存率有密切关联。研究[12-14]报道：miRNA-21能够下调金属蛋白酶抑制因子1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases 1，TIMP1)、第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物(phosphate and tension homology deleted on chromsome 10，PTEN)和程序性细胞死亡因子4(programmed cell death 4，PDCD4)等抑癌基因的表达，并起到致癌作用。
本研究分析2种乳腺癌细胞株T47D和MDA-MB-361的放射敏感性，结果显示：给予同样剂量照射时，MDA-MB-361细胞存活率明显低于T47D细胞, 证实其具有更强的放射敏感性；2种细胞中miRNA-21表达水平均明显高于正常乳腺组织，但是T47D细胞拥有更高的miRNA-21表达；2种乳腺癌细胞在照射后8 h内均表现出明显的miRNA-21表达上调，提示miRNA-21与乳腺癌细胞的放射抗性有关。狄英波等[15]研究了3种乳腺癌细胞的放射敏感性发现：miRNA-21的表达从高到低分别为MDA-MB-231、MCF7和MDA-MB-435s，而克隆形成实验显示辐射敏感性从高到低为MDA-MB-435s、MCF7和MDA-MB-231，两者呈负相关关系，与本研究结果类似。
GABRIELY等[16]在乳腺癌细胞株MCF7中敲除了miRNA-21表达，结果显示：miRNA-21表达敲除后MCF7细胞体外增殖能力和小鼠异种移植瘤生长均被抑制，该抑制作用伴随着MCF7细胞凋亡率的升高。为探讨miRNA-21与乳腺癌放射敏感性的关系，本研究采用慢病毒转染的方法降低了T47D和MDA-MB-361细胞中miRNA-21表达，miRNA-21表达的下调明显降低了在放射条件下的2种细胞的细胞存活率，提示其表达下调能够起到乳腺癌放射增敏作用。但T47D细胞存活率仍高于MDA-MB-361细胞，可能是虽然anti-miRNA-21转染降低了miRNA-21的表达，但T47D细胞中miRNA-21表达仍明显高于MDA-MB-361细胞的缘故。
本研究结果显示：γ射线照射后T47D和MDA-MB-361细胞产生明显的G2/M期细胞阻滞，与多数研究[15]报道一致，且具有较强放射抗性的T47D细胞表现出较低的G2/M期细胞阻滞。放射治疗能引起肿瘤细胞DNA损伤，细胞在DNA双链断裂之后会立即启动检查点，以暂时停止细胞周期进程，主要的检查点在G1/S期和G2/M期，肿瘤细胞的放射敏感性主要与G2/M期阻滞引起的细胞周期延长有关，这也与本研究中2种乳腺癌细胞阻滞在G2/M期一致[17-19]。当转染降低miRNA-21表达后，流式细胞术结果显示：T47D细胞的G2/M期百分率由64.0%降至22.9%，明显消除了放射引发的G2/M期阻滞，而凋亡峰subG1期细胞却明显增加。ANASTASOV等[20]研究表明：不可逆的G2 /M期阻滞导致了乳腺癌细胞的放射抵抗，提示miRNA-21通过介导G2 /M期阻滞调节乳腺癌细胞的放射抗性。本研究中，由于5.0 Gyγ射线照射anti-miRNA-21组MDA-MB-361细胞存活率低至(6.2±3.1)%，与照射前比较，MDA-MB-361的细胞周期分布差异无统计学意义，故仅报道了T47D细胞的周期分布结果。
本研究明确了miRNA-21在人乳腺癌细胞中的放射敏感性中的调节作用，其机制与抑制细胞周期G2/M期阻滞有关。本研究结果为乳腺癌的临床靶向治疗提供了实验依据。
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