结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是最常见的胃肠道肿瘤之一，在全球范围内其发病率居恶性肿瘤的第3位。随着外科技术的进步和放疗及化疗药物的使用，CRC患者的预后明显改善，但仍有40%~50%的CRC患者存在复发和转移。在影响CRC的诸多因素中，CRC微环境中的多种免疫细胞和肿瘤引流淋巴结(tumor draining lymph nodes, TDLN)起重要作用，其对CRC的早期诊断和治疗具有重要意义。

调节性T细胞(regulatory T cells, Tregs)代表调节自身免疫反应的CD4⁺辅助T细胞亚群^[1]。Foxp3是Tregs特异且可靠的标志^[2-3]。Foxp3⁺Tregs通过抑制抗肿瘤免疫来促进肿瘤生长和转移^[4]。特别是在CRC中，Tregs被认为在控制促肿瘤慢性炎症中发挥有益作用^[5]。本课题组的前期工作证实：CRC组织中的Tregs浸润明显高于癌旁正常组织。目前，Tregs在TDLN中的表达及其与其他免疫细胞的关系国内外尚未见相关报道。树突状细胞(dentritic cells, DCs)是一种功能强大的抗原呈递细胞，T细胞与DCs的相互作用是肿瘤有效免疫应答的基础。DCs由髓样树突状细胞(myeloid dentritic cells, mDCs)和浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dentritic cells, pDCs)组成。pDCs在保护性免疫和免疫耐受中发挥作用^[6-7]。mDCs是功能最强的专职抗原呈递细胞，是机体免疫应答的始动者^[8]。mDCs与肿瘤的发生发展有密切关联^[9]。研究^[10]显示：mDCs对Tregs在胸腺的选择及在外周淋巴样组织中分化、增殖的功能具有重要的调节作用。目前CRC患者癌组织中CD11c⁺ mDCs和Foxp3⁺ Tregs是否对CRC患者的临床进展和预后有影响尚不清楚。

本研究分析Foxp3⁺ Tregs和CD11c⁺ mDCs在原发肿瘤和TDLN组织中的浸润情况，探讨其与CRC临床病理参数的相关性，旨在阐明其在免疫中的潜在作用。

收集2008—2011年吉化集团公司总医院CRC患者手术切除的标本52例；均取癌组织和癌旁正常组织(距离肿瘤边缘>5 cm处)。所有病例均经病理诊断证实，且术前未经放疗或化疗，其中男性29例，女性23例，年龄47~82岁，平均年龄为64岁。患者及其家属均知情同意，本研究经吉化集团公司总医院伦理委员会批准。临床病理报告中包括性别、年龄、位置、组织学类型、肿瘤淋巴结转移(TNM)、肿瘤浸润深度、淋巴结是否转移和肿瘤分化程度等临床病理指标。根据2000年WHO关于CRC的诊断标准进行分类：47例标本为管状腺癌，5例为黏膜癌。肿瘤分化：6例样本分化良好，41例样本分化程度较低。52例患者中20例有淋巴结转移，32例无淋巴结转移。根据国际癌症控制联盟(UICC 2002)标准，14例患者为T1+T2组，38例为T3+T4组。根据2002 UICC分期系统的TNM分期标准，30例为Ⅰ+Ⅱ期组，22例为Ⅲ+Ⅳ期组。

小鼠抗人Foxp3单克隆抗体(武汉博士德公司)，小鼠抗人CD11c单克隆抗体(北京杉木金桥生物技术公司)，即用型免疫组织化学超敏SP试剂盒、DAB显色试剂盒和多聚赖氨酸均为福州迈新生物技术公司产品，其他为国产分析纯。包埋机和切片机(LEICA RM-2245，德国隆合实业公司)，生物显微镜(日本Olympus公司)。

所有标本经固定、脱水、透明、包埋后制成4 μm厚连续切片，按照免疫组织化学SP试剂盒说明书进行操作。组织切片常规脱蜡、水化，3% H₂O₂室温下孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶活性，热诱导抗原修复2 min。室温冷却，PBS冲洗，非免疫动物血清封闭10 min。切片分别滴加Foxp3抗体和CD11c单克隆抗体4℃过夜，PBS洗涤切片, 滴加辣根过氧化物酶二抗，室温20 min。PBS洗涤3次后，DAB显色，切片脱水，清洗和中性树胶封片。每个样本重复检测2次。检测CDC患者癌组织和癌旁组织中Foxp3⁺Tregs和CD11C⁺mDCS的表达频数。

采用双盲法评估所有载玻片。高倍镜(×400)下随机选取10个视野，每个视野计数100个细胞，计数阳性细胞数，取阳性细胞数的平均值。阳性细胞数≤ 20为低表达，阳性细胞数>20为高表达。

采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。CRC患者癌组织和癌旁组织中Foxp3⁺Tregs和CD11c⁺mDCs表达频数以x ±s表示，其与患者临床病理特征的关系分析采用t检验；CRC组织和TDLN中Foxp3⁺ Tregs和CD11c⁺mDCs的浸润及相关性分析采用Spearman秩相关性分析。以P < 0.05表示差异有统计学意义。

Foxp3⁺ Tregs阳性表达呈棕黄色颗粒，主要定位于肿瘤细胞的细胞核中，Foxp3⁺Tregs散在分布于CRC肿瘤组织和周围正常黏膜中，其在CRC组织中的表达频数(8.07 /HPF)明显高于相邻正常黏膜组织(0.96 /HPF) (P < 0.01)，见图 1A(插页五)。CD11c⁺ mDCs阳性表达为棕黄色颗粒，主要定位于细胞膜中。CRC患者癌组织中CD11c⁺ mDCs主要分布于肿瘤细胞边缘或者肿瘤基质中，其形状不规则，大小不一，常伴有淋巴细胞浸润。在CRC肿瘤组织中的表达频数(6.72/HPF)明显增加，与癌旁正常黏膜组织(2.32/HPF)比较差异有统计学意义(P < 0.01)，见图 1B(插页五)。

A: Foxp3 Tregs; B: CDllc+mDCs. 图 1  CRC患者癌组织中Foxp3+Tregs和 CD11c+mDCs的表达(HE, ×400) Fig. 1 Expressions of Foxp3+Tregs and CD11c+mDCs in cancer tissue of CRC patients (HE, ×400)

图选项

TNM分期Ⅰ+Ⅱ期组患者癌组织中Foxp3⁺Tregs表达频数明显高于TNM分期Ⅲ+Ⅳ期组(P < 0.01)，淋巴结转移阳性组CRC患者癌组织中Foxp3⁺Tregs表达频数明显高于淋巴结转移阴性组(P < 0.01)，Foxp3⁺Tregs表达频数与患者年龄、肿瘤类型、肿瘤浸润深度和肿瘤分化程度无关联(P> 0.05)。

肿瘤浸润深度T3+T4组患者CD11c⁺mDCs表达频数明显低于肿瘤浸润深度T1+T2组(P < 0.05)；CD11c⁺mDCs在CRC患者癌组织中的表达频数随着TNM分期的递增而降低，组间比较差异有统计学意义(P < 0.01)；淋巴结转移阴性组CRC患者癌组织中CD11c⁺mDCs的表达频数明显高于淋巴结转移阳性组(P < 0.01)。见表 1。

Foxp3⁺Tregs分布于淋巴结的副皮质区。在mTDLN组织中Foxp3⁺Trges的表达频数(8.2/HPF)明显高于mfTDLN组织(5.5/HPF) (P < 0.01)。CD11c⁺ mDCs主要分布在淋巴结的副皮质区和癌巢。mTDLN组织中mDCs表达频数(3.55/HPF)明显低于mfTDLN组织(9.03/HPF) (P < 0.01)。见图 2(插页五)。

图 2 CRC患者mTDLN和mfTDLN组织中Foxp3+Tregs和CD11c+mDCs的表达(HE，×400) Fig. 2 Expressions of Foxp3+Tregs and CD11c+mDCs in mTDLN and mfTDLN tissuesof CRC patients(HE,×400)

图选项

CRC患者癌组织中Foxp3⁺Tregs表达和CD11c⁺mDCs表达的Spearman相关系数为－0.29，无明显相关性(P=0.063)；TDLN组织中Foxp3⁺Tregs和CD11c⁺mDCs表达的Spearman相关系数为-0.30，无明显相关性(P=0.137)。

由于肿瘤的免疫逃避机制对抗机体的免疫系统，免疫治疗逐渐成为肿瘤综合治疗的组成部分。Foxp3的特异性表达对Tregs的分化发育和功能至关重要^{[1, 11]}。研究^[12-15]显示：CD4⁺CD25⁺Tregs在多种肿瘤的CD4⁺T细胞中的比例异常升高，例如肺癌、乳腺癌、卵巢肿瘤和淋巴结转移性黑色素瘤等。研究^[16-17]显示：Tregs可抑制CD4⁺ T细胞增殖，抑制肿瘤特异性抗原激活的CD4⁺效应T细胞分泌IL-2。SATO等^[18]发现：卵巢癌患者CD8⁺ T细胞在肿瘤组织中的显著增加可以提高患者的生存率，Tregs对效应CD8⁺T细胞介导的抗肿瘤免疫反应有抑制作用，提示提高肿瘤特异性CD8⁺ T细胞和减少Tregs细胞可有效地改善癌症患者的预后。因此，在以细胞为主的肿瘤免疫过程中，Tregs处于关键环节，决定了免疫反应是趋向于诱导耐受还是免疫激活。本研究结果显示：CRC患者癌组织中Foxp3⁺Tregs的表达频数明显高于邻近的癌旁组织，Foxp3⁺Tregs表达与淋巴结转移和TNM分期有密切关联。淋巴结转移和TNM分期是判断肿瘤患者预后和存活时间的重要指标。本研究结果提示：Foxp3⁺Tregs表达与CRC转移及预后不良有关。随着肿瘤转移，Tregs介导的免疫抑制有增强趋势，肿瘤细胞可能有更多的机会直接或间接地与免疫细胞接触。

mDCs是一种专门启动和调节免疫的抗原呈递细胞，可有效诱导原发性T细胞反应，从而启动机体的免疫反应，产生抗肿瘤免疫^[19]。研究^[20]显示:CRC患者癌组织中mDCs数比正常黏膜组织中增加大约3倍，该现象的机制尚不清楚，可能与mDCs抗肿瘤的免疫反应有关。本文作者推测：在CRC肿瘤抗原刺激的作用下，mDCs从机体的其他部分迁移到肿瘤组织中。以往研究认为在肿瘤组织中每高倍视野大于等于20个mDCs即可认定是高度浸润，根据这一标准，在CRC癌组织中6.72 /HPF并未达到抗肿瘤免疫反应的程度，这可能是CRC局部组织免疫缺陷的原因之一。由于表达频数和功能的降低，mDCs被认为是抗肿瘤免疫中的负性因素^[21]，本文作者研究CD11c⁺mDCs表达与患者临床病理参数关系结果显示：有淋巴结转移患者CD11c⁺mDCs表达频数明显低于无淋巴结转移患者，CD11c⁺mDCs表达水平随TNM分期的增加而降低。因此，在CRC癌组织中CD11c⁺mDCs的表达水平通常可以反映肿瘤的免疫状态。在肿瘤免疫中，TDLN是肿瘤细胞沿淋巴管所能到达的淋巴结，是肿瘤发生免疫反应的主要场所。同时，TDLN也是肿瘤发生免疫耐受的主要场所^[22]。在TDLN组织中，由于肿瘤免疫耐受而非诱导免疫攻击，从而促进肿瘤的进展，即mfTDLN和mTDLN组织均受肿瘤免疫耐受的影响。在mTDLN组织中，由于肿瘤细胞产生致瘤因子作用，肿瘤免疫耐受更加明显。本文作者观察mTDLN是否由于暴露于致瘤因子中从而比mfTDLN更容易受到免疫抑制，分析了Foxp3⁺Tregs和D11c⁺mDCs的表达情况，结果显示：mTDLN组织中Foxp3⁺Tregs的表达频数较高，而mTDLN组织中CD11c⁺mDCs的表达频数明显低于mfTDLN组织。本研究结果表明：在mTDLN中存在肿瘤细胞可以降低原位抗肿瘤免疫应答，促进肿瘤的进展。

上述结果表明：Foxp3⁺Tregs表达和CD11c⁺mDCs表达均与CRC中的恶性肿瘤生物表型有关。研究^[10-11]显示：mDCs与胸腺Tregs的选择、外周淋巴组织的分化和增殖及功能调节有关。研究^[23]显示mDCs具有主动免疫抑制和诱导肿瘤免疫耐受的作用。但目前对肿瘤部位mDCs与Tregs相互作用的关系、对不同DCs亚型的活性和功能调控的认识尚不明确。本研究结果显示：CRC癌组织和TDLN组织中Foxp3⁺Tregs表达与CD11c⁺mDCs表达无相关性。本文作者推测肿瘤组织中DCs亚群的转移可能打破抗肿瘤免疫应答的平衡，促进肿瘤细胞的生存。

综上所述，Foxp3⁺Tregs在CRC癌组织和TDLN组织中表达频数较高。而随着CRC的进展，CD11c⁺mDCs在TDLN组织和肿瘤间质中的表达频数减少，两者均与恶性肿瘤生物表型密切相关。Foxp3⁺Tregs和CD11c⁺mDCs在抑制肿瘤微环境的细胞免疫中发挥作用。