非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌中最常见的类型，占肺癌患者的75%~80%，具有恶性程度高、增殖速率快、易复发和易耐药的特点^[1]，其常用化疗药物之一为吉西他滨，以吉西他滨为基础的单药化疗或联合化疗能有效提高NSCLC患者的生存率，但其耐药性限制了临床疗效，并且目前缺乏有效的指标来预测NSCLC对吉西他滨的耐药性。NSCLC的耐药是一个复杂的过程，涉及大量基因异常表达以及相关信号通路的异常。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号传导通路在NSCLC细胞增殖、侵袭和耐药中扮演重要角色^[2-3]。葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)在恶性肿瘤细胞中过表达，而在正常细胞中低表达甚至不表达。研究^[4]表明：过表达GRP78能导致Akt和PI3K的磷酸化水平增加，进而增加肿瘤细胞活力。研究^[5]表明：GRP78过表达可以导致肿瘤细胞对多种化疗药物耐药，但其机制尚不明确，并且其是否与NSCLC对吉西他滨的耐药有关目前尚未见报道。本研究分析GRP78在经吉西他滨治疗的NSCLC患者癌组织中的表达水平和治疗效果，并在此基础上在过表达GRP78的肺腺癌SPCA1细胞中应用RNA干扰技术下调GRP78的表达，观察GRP78对吉西他滨化疗敏感性的影响，进一步探讨其作用机制，从而为临床上吉西他滨治疗NSCLC提供新的线索。

收集2015年1月—2017年1月于锦州医科大学附属第一医院手术切除并经病理证实的NSCLC石蜡包埋组织标本35例，患者的中位年龄为60岁，均为采用吉西他滨单药化疗治疗者的标本。35例患者中能评价疗效者32例，均在化疗2个周期后给予全面检查，进行疗效评估，另外3例仅行化疗1个周期，未进行疗效评估。治疗方案：成人推荐吉西他滨剂量为1 000 mg·m^-2，静脉滴注30 min，每周1次，连续3周，随后休息1周，每4周重复1次，依据患者的毒性反应相应减少剂量。疗效评价：采用实体瘤疗效评价法(RECIST)对患者的化疗效果进行评价，疗效评价分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、疾病稳定(SD)和疾病进展(PD)，缓解包括CR和PR，未缓解包括SD和PD。

人肺癌细胞系SPCA1、A549和H3255由北京生命科学研究院陈良研究员惠赠。RPMI 1640培养液和胎牛血清购于美国Gibco公司，SP试剂盒和DAB试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司，GRP78-shRNA和对照载体购于上海吉玛基因公司，Lipofectamine2000购于美国Invitrogen公司，吉西他滨购于美国Selleck Chemicals公司(批号：S171403)，GRP78、Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K和β-actin抗体购于美国CST公司，HRP标记的二抗和ECL发光试剂购于上海碧云天公司。

二甲苯和梯度乙醇脱蜡、枸橼酸钠缓冲液高压修复，过氧化氢孵育封闭内源性过氧化酶，GRP78兔抗人单克隆抗体1:200稀释，4℃过夜。次日，滴加HRP标记的羊抗兔二抗，37℃孵育40 min，DAB显色，苏木精复染，分化，脱水，封片。GRP78在细胞质中表达，以抗体在细胞质中出现棕黄色或棕褐色判定为阳性反应，对结果进行半定量分析。染色强度评分：0分为无着色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色；染色阳性率评分：0分为阴性，1分为≤25%，2分为25%~50%，3分为51%~75%，4分为≥75%。以染色强度评分和染色阳性率评分的乘积作为总评分并进行分组，0~5分为低表达组，6~12分为高表达组。染色结果由2名资深病理科医生进行评分与核准。

将SPCA1、A549和H3255细胞培养于含10% FBS和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养液中，培养条件为37℃、5% CO₂。转染按Lipofectamine2000说明书进行操作。将细胞接种于6孔细胞培养板中，转染前12 h更换为不含抗生素的完全培养液中。当细胞密度达到80%时，开始转染，转染后48 h应用Western blotting法检测转染效率。转染体系为500 μL，质粒DNA与转染试剂的比例为2:5，其中质粒用量为6 μg，Lifectamine2000试剂体积为15 μL，将SPCA1细胞分为对照组(给予shNC)和干扰组(给予shGRP78)，shGRP78序列为5′-GCCTAAATGTTATGAGGATCA-3′，同时设计shNC序列为5′-GTTCTCCGAACGTGTCACG- T-3′。

将处理后的细胞采用RIPA缓冲液(含1% NP-40、0.5%脱氧胆酸钠、1% SDS和0.1% PMSF)裂解，BCA法定量，SDS-PAGE电泳，转膜，3% BSA封闭，加入GRP78兔抗人单克隆抗体(1:1 000稀释)，4℃过夜，TBST洗膜后加入HRP标记羊抗兔二抗室温孵育1 h，ECL显色，得到GRP78条带，内参采用β-actin。

将对照组和干扰组中SPCA1细胞按每孔5 000个细胞的密度接种于96孔细胞培养板，12 h后，采用含有吉西他滨的0.5%血清的培养液处理细胞后继续培养48 h，加入MTT试剂继续培养4 h后，DMSO溶解沉淀，采用酶标仪于490 nm处测定各孔的吸光度(A)值，计算各组细胞活力。细胞活力=给药组A值/空白组A值×100%，实验重复3次，绘制细胞活力图。

设立阴性对照组、干扰组、对照+吉西他滨组和干扰+吉西他滨组，各组SPCA1细胞按每孔1 000个细胞的密度接种于6孔细胞培养板，按分组情况给予药物，药物作用时间约为2周，待阴性对照组细胞即将长满则终止培养，甲醛固定30 min，结晶紫染色15 min，洗去染色液，空气风干，照相，计算克隆形成率。克隆形成率=处理组细胞数/阴性对照组细胞数×100%。

分组同1.7中。将各组处理后的细胞用RIPA缓冲液(含1% NP-40、0.5%脱氧胆酸钠、1% SDS和0.1% PMSF)裂解，BCA法定量，SDS-PAGE电泳，转膜，3% BSA封闭，加入Akt、p-Akt、PI3K和p-PI3K兔抗人单克隆抗体(1:1 000稀释)，4℃过夜，TBST洗膜后加入HRP标记羊抗兔二抗，室温孵育1 h，ECL显色，分别得到Akt、p-Akt、PI3K和p-PI3K条带，内参采用β-actin。

采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。各组细胞活力和克隆形成率均以x±s表示，计量资料数据符合正态分布，多组间比较采用单因素方差分析。NSCLC患者手术切除组织中GRP78阳性表达率组间比较采用χ²检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

免疫组织化学染色结果显示：在32例经吉西他滨治疗的NSCLC患者手术切除组织中，GRP78主要表达于NSCLC组织的细胞质内，呈棕黄色或棕褐色；其中12例经吉西他滨治疗缓解患者中，5例GRP78表达为强阳性；而20例吉西他滨治疗未缓解的患者中，17例GRP78表达为强阳性；故经吉西他滨治疗未缓解患者NSCLC组织中GRP78阳性表达率(85%)治疗明显高于缓解者(41.7%)(P < 0.05)。见图 1(插页四)。

A-B:Lung squamous cell carcinoma tissue; C-D : Lung adenocarcinoma tissue; A, C:Remission after treated with gemcitabine; B, D:No remission after treated with gemcitabine 图 1 经吉西他滨治疗缓解和未缓解NSCLC患者癌组织中GRP78的表达（免疫组织化学，×200） Fig. 1 Expressions of GRP78 in cancer tissue in remission and no remission NSCLC patients after treated with gemcitabine(Immunohistochemistry, ×200)

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Western blotting法检测A549、H3255和SPCA1细胞中GRP78表达情况结果显示：在这3种细胞中GRP78均有表达，其中在SPCA1细胞中GRP78表达量最高，因此选定SPCA1细胞用于后续研究，见图 2。RNA干扰实验结果显示：与对照组比较，干扰组SPCA1细胞中GRP78表达量明显降低，见图 3。

Lane 1:A549 cells; Lane 2:H3255 cells; Lane 3:SPCA1 cells. 图 2 Western blotting法检测A549、H3255和SPCA1细胞中GRP78表达电泳图 Fig. 2 Electrophoregram of expressions of GRP78 in A549, H3255 and SPCA1 cells detected by Western blotting method

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Lane 1:Control group; Lane 2:Interference group. 图 3 Western blotting法检测RNA干扰后SPCA1细胞中GRP78表达电泳图 Fig. 3 Electrophoregram of expressions of GRP78 in SPCA1 cells after RNA interference detected by Western blotting method

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与对照组比较，干扰组细胞活力明显降低，随着吉西他滨浓度的增加，细胞活力随之明显降低，呈现明显的浓度依赖性(P < 0.05)，见图 4。克隆形成实验结果显示各组SPCA1细胞呈克隆形成形态表现，见图 5(插页四)。与阴性对照组(100%)比较，干扰组SPCA1细胞克隆形成率(47.60%±1.70%)明显降低(P < 0.05)，而干扰+吉西他滨组SPCA1细胞克隆形成率(17.30%±1.95%)降低更明显(P < 0.05)。见图 6。

*P < 0.05 compared with control group. 图 4 MTT法检测不同浓度吉西他滨作用下各组SPCA1细胞活力 Fig. 4 Viabilities of SPCA1 cells in various groups after treated with different concentrations of gemcitabine detected by MTT assay

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A:Control group; B:Interference group; C:Control + gemcitabine group; D:Interference + gemcitabine group 图 5 各组SPCA1细胞克隆形态表现 Fig. 5 Morphology of SPCA1 cell clones in various groups

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1:Negative control group; 2:Interference group; 3:Control + gemcitabine group; 4:Interference + gemcitabine group.*P < 0.05 compared with negative control group; △P < 0.05 compared with interference group; #P < 0.05 compared with control + gemcitabine group. 图 6 各组SPCA1细胞克隆形成率 Fig. 6 Clone formation rates of SPCA1 cells in various groups

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与阴性对照组比较，干扰组SPCA1细胞中p-Akt和p-PI3K表达量降低，而干扰+吉西他滨组SPCA1细胞中p-Akt和p-PI3K表达量降低更加明显。见图 7。

Lane 1:Negative control group; Lane 2:Interference group; Lane 3:Control +gemcitabine group; Lane 4:Interference + gemcitabine group. 图 7 各组SPCA1细胞中Akt、p-Akt、PI3K和p-PI3K表达电泳图 Fig. 7 Electrophoregram of expressions of Akt, p-Akt, PI3K, and p-PI3K in SPCA1 cells in various groups

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NSCLC在肺癌中占比较高，外科手术切除肿瘤组织后，以化学治疗手段为主，吉西他滨作为NSCLC一线化疗药物，近年来其治疗NSCLC的有效率越来越低，这与肿瘤细胞对吉西他滨耐药有密切关系^[6-7]。吉西他滨在肿瘤细胞内耐药的机制相对复杂，多种相关蛋白和因子参与其中，因而其耐药性的产生可由多种原因所致^[8-9]，BRD4在三阴乳腺癌中可增加吉西他滨的抵抗性^[10]。

GRP78是一种多功能蛋白质，属于热休克蛋白70家族^[11]。GRP78在肿瘤细胞中过表达，对肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移等生物学特性具有重要的调节作用，在NSCLC中，过表达GRP78可促进肺癌细胞的转移^[12]。研究^[13-14]显示:GRP78在多种肿瘤中可以导致肿瘤细胞对化学药物治疗抵抗，在肝细胞癌细胞中过表达GRP78可以导致肿瘤细胞对sorafenib产生获得性耐药^[15-16]。因此GRP78与肿瘤耐药性存在密切关系，其独特的生物学特性和功能使之在肿瘤治疗中受到关注^[17]。本研究结果显示：GRP78在经吉西他滨治疗耐药的NSCLC患者手术切除的肿瘤组织中呈高表达，提示GRP78过表达可能与NSCLC对吉西他滨的耐药性有关。本研究进一步通过RNA干扰内源性高表达GRP78的肺腺癌SPCA1细胞，观察其对吉西他滨药物敏感性的影响来验证假设，结果显示：沉默GRP78可降低SPCA1细胞活力，并且增强吉西他滨对SPCA1细胞的敏感性，提示沉默GRP78可以增加NSCLC细胞对吉西他滨的反应性。

PI3K/Akt信号通路广泛存在于人体细胞中，稳定的PI3K/Akt信号通路参与正常的细胞生理活动过程，但在恶性肿瘤细胞中，PI3K/Akt信号通路处于一种过度激活的状态^[18-19]。过度激活的PI3K/Akt信号通路通过调节肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和耐药性等，维持肿瘤细胞的恶性程度^[20-22]。本研究结果表明：通过沉默GRP78部分抑制了PI3K/Akt信号通路，降低了肺腺癌SPCA1细胞的活力。沉默GRP78增加了吉西他滨对PI3K/Akt信号通路的抑制作用，提示GRP78可以通过PI3K/Akt途径导致NSCLC对吉西他滨耐药。

综上所述，靶向GRP78可能是潜在、高效的治疗NSCLC手段，本研究结果为临床实践中吉西他滨耐药提供了新的思路，但具体机制和应用价值还需进一步研究。