吉林大学基础医学院病原生物学教研室, 吉林 长春 130021
收稿日期: 2018-09-10
基金项目: 吉林省科技厅省级医药健康产业发展专项基金资助课题(20180311003YY)
作者简介: 王紫嫣(1994-), 女, 辽宁省鞍山市人, 在读理学硕士, 主要从事药效学评价和抗菌肽方面的研究。
Therapeutic effects of YiXuanNing Granule on ischemic vertigo of mice and rats and their mechanisms
Department of Pathogen Biology, School of Basic Medical Sciences, Jilin University, Changchun 130021, China
眩晕是指前庭神经系统病变及相应的中枢缺血引发的空间定位障碍和平衡功能失调所导致的运动性幻觉[1]。调查[2]显示:成年人眩晕患病率高达20%~30%,严重危害人们的健康。眩晕病因复杂,椎-基底动脉供血不足、美尼尔症和颈椎病等是最常见的诱因,其中脑血管病占比高达85.4%[1, 3]。研究[4-6]显示:中枢缺血与氧化应激、细胞凋亡和炎症反应密切相关。历代医家[7-8]有“无虚不作眩”之说,认为“气血亏损、脑海失养”是眩晕的主要诱因。抑眩宁颗粒为中药复方制剂,由胆南星、枸杞子和生铁落等中药精制而成,其对肝阳上亢,气血两虚型眩晕具有明显的疗效[9],但是其具体机制尚不明确。本研究制备缺血性眩晕大鼠和小鼠模型,测定其行为学改变、脑组织炎症反应和氧化应激反应,探讨抑眩宁颗粒对缺血性眩晕的治疗作用,并阐明其作用机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物 60只SPF级Wistar大鼠,雌雄各半,体质量180~220 g;60只SPF级ICR小鼠,雌雄各半,体质量18~22 g;购自吉林省长春市亿斯实验动物技术有限责任公司,许可证号:SCXK(吉)-2016-0003。所有实验均符合吉林大学关于动物实验的管理条例。
1.2 药物、主要试剂和仪器 抑眩宁颗粒(通化茂祥制药有限公司),盐酸氟桂利嗪胶囊(湖南迪诺制药有限公司)。肿瘤坏死因子α (TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β) ELISA试剂盒(上海联科生物有限公司),超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)检测试剂盒(上海联科生物有限公司)。组织匀浆机(拜普诺公司,北京),大鼠和小鼠跳台记录仪(YLS-3TB,济南益延公司),酶标仪(ELx800,美国BioTek公司),恒温水浴锅(HHS型,上海博迅公司),离心机(FRESCO21,美国Thermo公司)。
1.3 各组小鼠跳台逃避时间测定 1.3.1 实验动物分组和给药 60只ICR小鼠随机分为正常对照组,模型组,低(2.25 g·kg-1)、中(4.50 g·kg-1)和高剂量(9.00 g·kg-1)抑眩宁颗粒组及阳性对照组(1.5 mg·kg-1盐酸氟桂利嗪),每组10只。各组小鼠均按10 mL·kg-1灌胃给药,每日1次,连续给药7 d,正常对照组和模型组小鼠给予等量生理盐水。每日给药1 h后进行跳台逃避电刺激训练,将小鼠放入跳台仪中,连续给予40 V、50 Hz电刺激,以跳上跳台并保持30 s不跌落为训练成功。每日训练2次,连续3 d,以建立牢固且稳定的逃避电刺激的条件反射。
1.3.2 各组小鼠跳台逃避时间 第7天给药1 h后,将模型组和给药组小鼠放在离心机中,500 r·min-1匀速旋转30 s后骤停,立即将小鼠置于跳台仪中,以40 V、50 Hz电刺激,记录小鼠受电击刺激后第1次跳上平台且30 s内不跌落的时间(不包括平台上的时间),即为跳台逃避时间。空白对照组小鼠直接进行跳台测试,不进行旋转[10-11]。
1.3.3 各组小鼠进食量测定 跳台测试结束后,各组小鼠给予50 g饲料,观察小鼠3 h内的活动能力,并在3 h后称量各组小鼠的饲料,记录各组小鼠进食量。进食量=50g-3 h后饲料质量。
1.4 各组大鼠跳台逃避时间测定 1.4.1 实验动物分组和给药 60只Wistar大鼠随机分为正常对照组,模型组,低(1.50 g·kg-1)、中(3.00 g·kg-1)和高剂量(6.00 g·kg-1)抑眩宁颗粒组及阳性对照组(1.00 mg·kg-1盐酸氟桂利嗪),每组10只。各组大鼠均按10 mL·kg-1灌胃给药,每日1次,连续给药7 d,正常对照组和模型组大鼠给予等量生理盐水。跳台逃避电刺激训练同1.3.1。
1.4.2 大鼠眩晕模型制备 第7天给药1 h后制备大鼠缺血性眩晕模型,大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(3.5 mL·kg-1)麻醉,仰位固定,剪开颈部皮肤,钝性分离肌肉,暴露双侧的颈总动脉(CCA),穿线结扎。正常对照组大鼠仅剥离CCA,不结扎血管[12]。
1.4.3 各组大鼠跳台逃避时间测试 次日给药1 h后进行跳台测试,将模型组和给药组大鼠置于离心机中,500 r·min-1匀速旋转30 s后骤停,立即将大鼠置于跳台仪中,以40 V、50 Hz电刺激,记录大鼠受电击刺激后第1次跳上平台且30 s内不跌落的时间(不包括平台上的时间),即为跳台逃避时间。正常对照组大鼠直接进行跳台测试,不进行旋转。
1.5 比色法和ELISA法测定各组大鼠脑组织中炎症反应和氧化应激相关因子水平 60只Wistar大鼠分组和造模方法同1.4。连续给药7 d后,麻醉处死大鼠,剪短颅骨和颈椎连接处,从枕骨大孔处伸入,朝向同侧眼眶方向贴骨头剪至眼眶,取出脑组织。取右侧半脑,生理盐水冲洗,滤纸吸干后精准称质量,按1:9加入生理盐水后匀浆。匀浆液3 500 r·min-1离心10 min后取上清,分装,-80℃保存。按照试剂盒说明书测定各组大鼠脑组织中SOD、MAD、TNF-α和IL-1 β水平。
1.6 统计学分析 采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析。各组小鼠和大鼠跳台逃避时间,小鼠进食量,各组大鼠脑组织中SOD活性和MDA、TNF-α及IL-1β水平均以x±s表示,多组间样本均数比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组小鼠和大鼠跳台逃避时间 与正常对照组比较,模型组小鼠跳台逃避时间明显增加(P < 0.01);与模型组比较,低、中和高剂量抑眩宁颗粒组及阳性对照组小鼠跳台逃避时间均明显缩短(P < 0.05或P < 0.01),且高剂量抑眩宁颗粒组和阳性对照组效果最为明显。与正常对照组比较,模型组大鼠跳台逃避时间明显增加(P < 0.01);与模型组比较,低、中和高剂量抑眩宁颗粒组及阳性对照组大鼠跳台逃避时间明显缩短(P < 0.05或P < 0.01)。见表 1。
表 1 各组小鼠和大鼠跳台逃避时间
Tab. 1 Escape time of jumping off platform of mice and rats in various groups
(n=10, x±s,t/s)
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Group |
Dose(g·kg-1) Mouse/Rat |
Escape time of jumping off platform |
Mouse |
Rat |
Normal control |
- |
4.5±12.5 |
53.3±25.7 |
Model |
- |
331.7±28.3* |
361.7±79.3* |
YiXuanNing Granule |
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Low dose |
2.25/1.50 |
245.1±33.9△ |
280.3±50.2△ |
Middle dose |
4.50/3.00 |
121.7±31.3△ |
121.0±90.0△△ |
High dose |
9.00/6.00 |
59.2±30.8△△ |
80.4±32.6△△ |
Positive control |
0.001 5/0.001 |
59.3±25.7△△ |
68.3±14.7△△ |
*P < 0.01 compared with normal control group; △P < 0.05, △△P < 0.01 compared with model group.
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2.2 各组小鼠进食量 跳台测试结束后,小鼠恢复进食。与模型组比较,各剂量抑眩宁颗粒组和阳性对照组小鼠活力均明显增强,3 h内进食量增多。
2.3 各组大鼠脑组织中SOD活性和MDA、IL-1β及TNF-α水平 与正常对照组比较,模型组大鼠脑组织中MDA、IL-1β和TNF-α水平明显升高(P < 0.01),SOD活性明显降低(P < 0.01)。与模型组比较,中和高剂量抑眩宁颗粒组及阳性药对照组大鼠脑组织中MDA、IL-1β和TNF-α水平明显降低(P < 0.05或P < 0.01),SOD活性明显升高(P < 0.05或P < 0.01);低剂量抑眩宁颗粒组大鼠脑组织中IL-1β和TNF-α水平降低,但差异无统计学意义(P>0.05),SOD活性明显升高(P < 0.05)。见表 2。
表 2 各组大鼠脑组织中SOD活性和MDA、IL-1β及TNF-α水平
Tab. 2 SOD activities and levels of MDA, IL-1β, and TNF-α in brain tissue of rats in various groups
(n=10, x±s)
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Group |
SOD[λB/(U·mg-1)] |
MDA[λB/(U·mg-1)] |
IL-1β[ρB/(ng·L-1)] |
TNF-α[ρB/(ng·L-1)] |
Normal Control |
29.74±1.78 |
3.02±0.52 |
25.39±3.25 |
25.39±3.21 |
Model |
20.81±1.15* |
6.56±0.34* |
43.93±2.36* |
43.93±2.73* |
YiXuanNing Granule |
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Low dose |
23.29±2.28△ |
5.19±0.32△△ |
36.88±2.68 |
36.88±2.42 |
Middle dose |
24.79±1.06△ |
4.49±0.39△△ |
35.73±2.73△ |
35.73±3.84△ |
High dose |
26.27±1.34△△ |
3.58±0.38△△ |
33.05±2.56△△ |
33.05±2.81△△ |
Positive control |
27.53±2.16△△ |
3.52±0.24△△ |
32.62±3.84△△ |
32.62±2.36△△ |
*P < 0.01 compared with normal control group; △P < 0.05, △△P < 0.01 compared with model group.
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3 讨论 眩晕是一种常见的临床症状,其发病率约为10%。研究[13]表明:脑血管病是引起眩晕的重要病因,占所有病因的85.4%,其中又以椎-基底动脉供血不足最为多见,占76%。本研究已建立牢固的逃避电击反射动物模型,在离心机中旋转后给予电刺激[14-15],动物出现不能跳台或在台上站立不稳滑落的状态,待动物清醒后才能跳上平台且不跌落,动物潜伏期稳定,适用于药物实验。本研究结果显示:连续给药7 d后,低、中和高剂量抑眩宁颗粒组大鼠跳台逃避时间均小于模型组,说明抑眩宁颗粒对大鼠抗眩晕功能具有改善作用。
免疫炎症反应在脑缺血损伤中起重要作用。大脑对炎症的反应受多种因素影响,包括中枢神经系统免疫细胞的激活和外周免疫细胞的脑浸润,两者均通过多种炎性细胞因子介导炎症过程[16-17]。IL-1β是促炎细胞因子,能够作用于多种细胞。IL-1β也是炎症急性期的关键介质,可诱发局部和系统反应,在参与脑缺血损伤的有害炎症过程中起关键作用[18]。脑缺血使体内TNF-α和IL-1β的合成机制被激活,导致TNF-α和IL-1β水平升高[19]。本研究结果显示:与正常对照组比较, 模型组大鼠脑组织中IL-1β和TNF-α水平明显升高;与模型组比较,低、中和高剂量组大鼠脑组织中IL-1β和TNF-α水平降低;证明抑眩宁颗粒对脑缺血引起的炎症反应有一定的抑制作用。
氧化应激反应在脑缺血损伤中起重要作用[20]。氧化应激指由机体产生的活性氧介导条件下,氧化与抗氧化物质失衡而引起的组织细胞氧化损伤[21]。自由基在体内大量存在,与许多生物大分子,特别是细胞质膜上的不饱和脂肪酸反应,从而破坏质膜[22]。在脑缺血的情况下,体内自由基含量升高,超过机体清除能力并造成损伤[23-25]。本研究结果显示:与正常对照组比较,模型组大鼠脑组织中SOD活性降低;与模型组比较,低、中和高剂量组大鼠SOD活性升高;与正常对照组比较,模型组大鼠脑组织中MDA水平升高;与模型组比较,低、中和高剂量组大鼠MDA水平降低;证明抑眩宁颗粒对脑缺血引起的氧化应激反应有一定的抑制作用。
综上所述,抑眩宁颗粒可以提高小鼠和大鼠抗眩晕能力,降低大鼠脑组织中IL-1β和TNF-α水平,减少炎症反应,增加脑组织中SOD活性,降低MDA水平,从而增强机体抗氧化能力。