肝细胞癌(hepatic cell carcinoma, HCC)是肝脏最常见的原发性恶性肿瘤，是慢性肝病的一种典型并发症，其病因及确切分子机制尚未完全清楚。HCC是全球第5位最常见的肿瘤，每年新增病例超过70万例^[1-2]。近年来，生物疗法或生物反应修饰疗法(主要包括免疫疗法)已成为继手术、放疗和化疗之后肿瘤治疗的第4种疗法^[3]。目前，由于化疗耐药和不良反应，大多数治疗性抗HCC药物疗效不佳，因此，寻找新的更有效的抗HCC药物势在必行。丹参是我国常用中药，具有活血化瘀和抗肿瘤功效，其主要化学成分为脂溶性的丹参酮类和水溶性的丹参酚酸类。目前国外研究^[4]显示：丹参对人肝癌HepG2细胞有生长抑制和诱导凋亡的作用。从活血化瘀中药丹参中提取出来的脂溶性有效成分为丹参酮ⅡA(Tan ⅡA)^[5]。关于TanⅡA对人肝癌HepG2细胞生长的抑制作用及对其迁移的影响国内外尚未见报道。本研究采用不同浓度TanⅡA作用于人肝癌HepG2细胞，探讨TanⅡA对人肝癌HepG2细胞的生长抑制、迁移作用和细胞凋亡的影响，为TanⅡA抗HCC的临床应用提供实验基础。

HepG2细胞株购于北京鼎国生物技术有限公司。二甲基亚砜(DMSO)和噻唑蓝(MTT)购于美国Sigma公司；Tan ⅡA购自中国食品药品检定研究院为国家药品化学标准物质，以DMSO溶解Tan ⅡA，配制成5 g·L^－1储存液，将该储存液置于－20℃冰箱内，避光保存待用；抗生素、DMEM细胞培养液、胰蛋白酶和胎牛血清均购于中国碧云天生物试剂公司；β-actin单克隆抗体以及抗兔二抗均购自英国Abcam公司；GAPDH、兔抗人基质金属蛋白酶9(MMP-9)和核转录因子κB(NF-κB) p65购自美国Santa Cruz公司；高纯度总RNA快捷提取试剂盒和逆转录cDNA试剂盒均购于美国BioTake公司；细胞周期检测试剂盒和TUNEL检测试剂盒购于中国碧云天生物技术公司。Tocan全自动凝胶成像系统购于中国上海领成生物科技有限公司，梯度PCR仪(型号：ETC811)购于中国东胜兴业科学仪器有限公司，AE2000倒置显微镜(MOTICAE2000)和流式细胞仪购于美国Beckman Coulter公司，Bio-Rad550酶标仪购于美国Bio-Rad公司。

采用含10%胎牛血清的DMEM完全培养液培养人肝癌HepG2细胞，并置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。

取对数生长期的HepG2细胞进行实验，每孔细胞密度为1.0×10⁴ mL^-1，接种于96孔细胞培养板，分为空白组和不同浓度Tan ⅡA组，复孔数为5，每孔接种200 μL，进行过夜培养。待细胞贴壁后，弃去培养液。空白组加入完全培养液继续培养24 h；不同浓度Tan ⅡA组加入终浓度为0.5、1.0、2.0、5.0和10.0 mg·L^-1的Tan ⅡA完全培养液继续培养24 h，倒置显微镜下观察细胞生长状态。48 h后向每孔加入20 μL新配制的5 g·L^-1MTT，轻轻摇匀，孵育4 h，弃去上清，每孔再加入200 μL DMSO，微振荡10 min，使其完全溶解，酶标仪检测波长490 nm处的吸光度(A)值并记录，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率= (1－Tan ⅡA组A值/空白组A值)×100%。

采用不同浓度Tan ⅡA处理细胞24 h后，倒置显微镜下观察各组HepG2细胞凋亡形态表观。

取灭活无菌直尺在无菌24孔板背面等距离划3条横线，以便标记和检测。收集对数生长期的HepG2细胞，将浓度为3.5 × 10⁵ mL^-1HepG2细胞接种于24孔培养板中，每孔100 μL，过夜培养。倒置显微镜下观察细胞，待80%细胞融合时，弃去培养液，更换为含2%血清的DMEM培养液，继续培养24 h饥饿细胞。待细胞单层贴壁长满时，在每孔单层细胞上采用20 μL加样枪头垂直于3条横线划痕，形成划痕模型。划痕后采用PBS冲洗3次，分为空白组和不同浓度Tan ⅡA组，每组设置2个复孔。24孔板分别加入100 μL含2%血清的DMEM，不同浓度Tan ⅡA组再加入终浓度为1.0、2.0和5.0 mg·L^-1的Tan ⅡA，继续培养24 h，并于0和24 h 2个时间点于倒置显微镜下观察划痕愈合程度。分别计数实验组和空白组在0和24 h时间点越过划痕边界的细胞数，并进行比对，从而反映细胞的平面迁移能力。以上实验至少重复3次。

提取细胞中总RNA，培养不同浓度Tan ⅡA作用下的细胞，0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞，收集细胞，并于1 000 r·min^-1离心5 min，弃去上清液，采用PBS洗涤2次；在1.5 mLEP管中离心沉淀，去除上清液；加入50 μL细胞裂解液，混匀，按照试剂盒说明书提取总RNA；采用逆转录酶试剂盒逆转录cDNA；PCR扩增已逆转录的cDNA为模板，在94℃、5 min的条件下进行初始变性，经过35个循环，94℃、1 min变性，55℃、1 min退火和72℃、1 min延伸过程，最后72℃、7 min充分延伸；120 V、30 min电泳。PCR引物序列见表 1。

培养24 h后，检测空白组和不同浓度Tan ⅡA组HepG2细胞的细胞周期，收集细胞培养液于离心管中备用。采用0.25%胰蛋白酶消化细胞，转移到备用的离心管中，1 000 r·min^-1离心5 min，去除上清，加入1 mL冰浴预冷的PBS，重悬细胞，再次离心，去除上清，轻轻弹击离心管，分散细胞避免细胞成团；固定细胞。采用1 mL冰浴预冷的70%乙醇，混匀，过夜固定。1 000 r·min^-1离心5 min，去除上清，加入1 mL冰浴预冷的PBS重悬细胞，再次离心，去除上清，轻轻弹击离心管，避免细胞成团；用每管样品中加入0.5 mL碘化丙啶染色液，4℃冰浴避光保存；采用流式细胞术检测各组不同细胞周期HepG2细胞百分比，进行分析。

将HepG2细胞悬浮培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，按每孔终浓度为2 × 10⁵mL^-1接种于24孔培养板，37℃、5% CO₂培养24 h后，不同浓度Tan ⅡA组HepG2细胞给药终浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0和10.0 mg· L^-1，37℃、5% CO₂继续培养24 h。24 h后各组HepG2细胞取上清液，1 500 r·min^-1离心12 min。按TUNEL检测试剂盒说明书操作。任选一个视野进行凋亡细胞计数，计算HepG2细胞凋亡率。HepG2细胞凋亡率=凋亡HepG2细胞数/HepG2细胞总数×100%。

采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析。各组HepG2细胞增殖抑制率、HepG2细胞中NF-κB和MMP-9 mRNA表达水平、不同细胞周期HepG2细胞百分比和HepG2细胞凋亡率均以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

倒置显微镜下可见空白组HepG2细胞生长状态良好，细胞间连接紧密；1.0和2.0 mg·L^-1Tan ⅡA组HepG2细胞体积缩小、连接疏散，间隙变大，细胞核固缩并碎裂，与周围细胞脱离，生长状态差，呈剂量依赖性。见图 1。

A: Blank group; B: 1.0 mg·L-1 Tan ⅡA group; C: 2.0 mg·L-1 Tan ⅡA group. 图 1 倒置显微镜下各组HepG2细胞形态表观(×400) Fig. 1 Morphology of HepG2 cells in various groups under inverted microscope (×400)

图选项

加入Tan ⅡA后，A值降低，细胞活性降低，细胞增殖抑制率升高。随着Tan ⅡA浓度的增加，细胞增殖抑制率也相应增加，1.0、2.0和10.0 mg·L^-1Tan ⅡA组HepG2细胞增殖抑制率与空白组比较差异有统计学意义(P < 0.01)。见图 2。

1:Blank group; 2:0.5mg·L-1 Tan ⅡA group; 3:1.0 mg·L-1 Tan ⅡA group; 4:2.0 mg·L-1 Tan ⅡA group; 5:5.0mg·L-1 Tan ⅡA group; 6:10.0mg·L-1 Tan ⅡA group. *P < 0.05 vs blank group. 图 2 各组HepG2细胞增殖抑制率 Fig. 2 Inhibitiory rate of proliferation of HepG2 cells in various groups

图选项

空白组人肝癌HepG2细胞培养24 h后向划痕边缘铺展，距离明显变小。Tan ⅡA组细胞向划痕边缘迁移的速度明显降低，划痕缺损处修复减慢。随着Tan ⅡA浓度升高，2.0和5.0mg·L^-1Tan ⅡA组HepG2细胞迁移的速度降低。见图 3。

A-D:0 h; E－H:24 h; A, E:Blank group; B, F:1.0 mg·L-1 Tan ⅡA group; C, G:2.0 mg·L-1 Tan ⅡA group; D, H:5.0 mg·L-1 Tan ⅡA group. 图 3 细胞划痕实验检测各组HepG2细胞迁移情况(×200) Fig. 3 Migration of HepG2 cells in various groups detected by cell scratch test (×200)

图选项

与0.5mg·L^-1Tan ⅡA组比较，1.0、2.0和5.0mg·L^-1Tan ⅡA组HepG2细胞中MMP-9和NF-κB mRNA表达水平明显降低(P < 0.05或P < 0.01)，且随着Tan ⅡA浓度升高呈现一定剂量依赖性。见图 4和5。

Lane 1:0.5 mg·L-1 Tan ⅡA group; Lane 2:1.0 mg·L-1 Tan ⅡA group; Lane 3:2.0 mg·L-1 Tan ⅡA group; Lane 4:5.0 mg·L-1 Tan ⅡA group. 图 4 各组HepG2细胞中NF-κB和MMP-9 mRNA表达电泳图 Fig. 4 Electrophoregram of expressions of NF-κB and MMP-9 mRNA in HepG2 cells in various groups

图选项

*P < 0.05, **P < 0.01 vs 0.5 mg·L-1 Tan ⅡA group.1:0.5 mg·L-1 Tan ⅡA group; 2:1.0 mg·L-1 Tan ⅡA group; 3:2.0 mg·L-1 Tan ⅡA group; 4:5.0 mg·L-1 Tan ⅡA group. 图 5 RT-PCR法检测各组HepG2细胞中NF-κB(A)和MMP-9(B) mRNA表达水平 Fig. 5 Expression levels of NF-κB(A) and MMP-9(B) mRNA in HepG2 cells in various groups detected by RT-PCR method

图选项

HepG2细胞经不同浓度TanⅡA作用48 h后，与空白组比较，不同浓度1.0、2.0和5.0和10.0mg·L^-1Tan ⅡA组S期HepG2细胞百分比降低(P < 0.05)，G₀/G₁期和G₂期HepG2细胞百分比升高(P < 0.05)。见图 6和7。

A:Blank group; B:0.5 mg·L-1 Tan ⅡA group; C:1.0 mg·L-1 Tan ⅡA group; D:2.0 mg·L-1 Tan ⅡA group; E:5.0 mg·L-1 Tan ⅡA group; F:10.0 mg·L-1 Tan ⅡA group. 图 6 流式细胞术检测各组HepG2细胞的细胞周期 Fig. 6 Cell cycles of HepG2 cells in various groups detected by flow cytrometry

图选项

*P < 0.05 vs blank group. 图 7 各组不同细胞周期HepG2细胞百分比 Fig. 7 Percentages of HepG2 cellsin different cell cycles in various groups

图选项

与空白组比较，不同浓度Tan ⅡA组HepG2细胞凋亡率明显升高(P < 0.05或P < 0.01)。当Tan ⅡA浓度达到10.0 mg·L^-1时，HepG2细胞凋亡率最高，见表 2。200倍荧光显微镜下各组细胞形态表现见图 8(插页三)。

A: Blank group; B-F:0.5, 1. 0, 2.0, 5.0 mg·L-1, and 10.0 mg·L-1Tan ⅡA groups. 图 8 TUNEL法检测各组HepG2细胞凋亡形态表现(×200) Fig. 8 Apoptotic morphology of HepG2 cells in various groups detected by TUNEL method (×200)

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HCC是死亡率高居第2位的恶性肿瘤，中国是每年HCC新增病例最多的国家^[6-13]。因此，寻找有效的抗肿瘤药物已成为科研工作者的重要任务之一。细胞增殖和凋亡之间的平衡失调可诱发肿瘤的形成；采用一种有效的治疗肿瘤的途径和方法，可能会诱导肿瘤细胞凋亡。因此，某些抗肿瘤药物作用的强弱与其诱导肿瘤细胞凋亡的活性成正比^[5]。

本研究结果表明：不同浓度Tan ⅡA能使HepG2细胞形态发生变化、细胞皱缩和连接消失，与周围细胞发生脱离。在一定细胞数范围内, 波长490 nm处采用酶标仪测定A值，可判断其活细胞数量。酶标仪测定的A值越大，代表细胞活性越强^[6]。本研究MTT实验结果显示：不同浓度Tan ⅡA均可明显抑制HepG2细胞增殖，并呈现一定的剂量依赖关系；细胞划痕实验结果显示：Tan ⅡA作用HepG2细胞后，HepG2细胞的运动和迁移抑制能力明显降低。恶性肿瘤的基本特征之一是侵袭和转移，癌细胞侵袭的始动条件则是黏附^[7-12]。肿瘤转移是肿瘤研究领域的瓶颈，癌症患者死于肿瘤转移者超过90%^[8]。

肿瘤通过多种蛋白水解酶，如基质金属蛋白酶(MMP)和尿激酶型纤溶酶原激活物等降解细胞外基质，从而使原位癌到局部侵袭及远处转移的演变过程中Ⅳ型胶原组成细胞外基质的基本骨架能够被明胶酶(MMP-2和MMP-9)降解。本研究结果显示：Tan ⅡA可抑制MMP-9 mRNA表达，且呈剂量依赖性。

NF-κB是一种转录因子，在正常情况下和适应性免疫反应的协调中起重要和决定性的作用，调节许多细胞介质的表达。研究^[14-15]显示：肝癌的进展伴随着NF-κB的激活。本研究结果显示：Tan ⅡA可抑制NF-κBmRNA表达，且呈剂量依赖性。

影响肿瘤的侵袭和转移因素有很多，其中一些分子与信号通路发挥重要作用。MMP可以通过降解细胞外基质及内皮细胞基底膜中的蛋白，参与肿瘤细胞的转移与侵袭过程^[9-19]。MMP是反映肿瘤转移变化的敏感指标，其中MMP-9具有明胶活性，在HCC的发生发展中起关键性作用^[9-17]。NF-κB为抗凋亡因子，其激活与肿瘤的侵袭生物特性有关，并且NF-κB活化炎性因子、MMP和黏附分子等水平影响许多肿瘤的浸润和转移。研究^[10-18]显示：HCC的浸润和转移行为与NF-κB激活MMP-9表达有关。本研究结果表明：不同浓度Tan ⅡA作用HepG2细胞后，细胞中NF-κB和MMP-9 mRNA表达水平呈现降低趋势，并呈剂量依赖性，表明Tan ⅡA可抑制HepG2细胞的迁移与转移，其诱发细胞凋亡可能与抑制NF-κB和MMP-9 mRNA表达有关。

Tan ⅡA是丹参重要的脂溶性成分之一，在白血病、肝癌和肺癌等的治疗中已得到广泛应用^[11-16]。本研究结果显示：不同浓度Tan ⅡA均能影响细胞周期，作用于人肝癌HepG2细胞24 h后，S期HepG2细胞百分比降低，表明Tan ⅡA可以将人肝癌HepG2细胞阻滞在G₁期，使进入S期的细胞减少，从而HepG2细胞在早期发生凋亡，抑制细胞增殖；Tan ⅡA浓度越高，G₁期阻滞越明显。Tan ⅡA的化学结构中含有菲醌结构，由于其菲环可与DNA结合以及其呋喃环和醌类结构可产生自由基、引起DNA的损伤和肿瘤细胞DNA的合成受到抑制，从而使Tan ⅡA作用后S期细胞百分比降低，G₀/G₁期细胞百分比升高^[20]。

综上所述，Tan ⅡA能够抑制人肝癌HepG2细胞发生迁移和转移，诱发细胞凋亡，Tan ⅡA对MMP-9表达的抑制作用可能是通过下调NF-κB mRNA表达来实现的，但其具体作用机制仍需要进一步探索。