骨组织是一个终生不断改建的组织，由成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收共同维持动态平衡，其具有保护、支持、造血、贮存和运动等功能^[1]。由口腔肿瘤、外伤和牙周炎等原因引起的骨量丢失是口腔医学领域常见的临床问题^[2]。牙周炎是一种发生在牙齿支持组织的慢性免疫炎症性疾病，可引起牙周结缔组织破坏和牙槽骨吸收^[3]。牙槽骨是人体骨骼系统中代谢和改建最活跃的部分。在生理情况下牙槽骨的吸收与形成维持动态平衡，故牙槽骨高度保持不变。当骨吸收增加、骨形成减少或二者并存时，即发生骨丧失，使牙槽骨高度降低。由于牙周炎引起牙槽骨的吸收，使牙齿的支持组织丧失，牙齿逐渐松动，最终脱落或拔除，不仅影响患者咀嚼、发音等生理功能，而且还严重影响患者的身心健康和生存质量。目前的骨缺损治疗方法中自体骨和异体骨移植等存在一定的缺点，例如供体部位的缺损、来源有限和免疫反应等^[4]。此外牵张成骨等具有操作技术复杂和价格昂贵的缺点。因此急需寻找一种新的骨再生材料。荧光碳点(carbon dots，CDs)是一种新型的光活性纳米材料，其荧光性质类似于常规半导体纳米晶中的荧光性质或量子点。CDs的结构相对简单，粒径小^[5]。溶液中的荧光量子产率高，并且在基板上的单个点级上的图像亮度好。此外，由于CDs具有毒性小和穿透率强等优点，近年来备受学者们广泛关注^[6-9]。本研究探讨葡萄糖酸锌碳点(Zn-CDs)在细胞成像及体外促进成骨分化中的作用，为进一步开展Zn-CDs的生物学应用提供科学依据。

小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1(中国科学院细胞库)。葡萄糖酸锌(上海麦克林生化科技有限公司)，噻唑蓝(MTT)粉剂(Amresco公司，美国)，40%甲醛、二甲基亚砜(DMSO)和95%乙醇(北京化工厂)，HG-DMEM培养基和胰蛋白酶(HyClone公司，美国)，胎牛血清和青-链双抗(Gibco公司, 美国)，β-甘油磷酸钠、地塞米松、抗坏血酸和茜素红(Sigma公司, 美国)，RNA提取试剂盒(广州美基生物科技有限公司)，反转录试剂盒和qRT-PCR试剂盒(TaKaRa公司, 日本)。CO₂恒温细胞培养箱(SANYO公司, 日本)，倒置荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜(Olympus公司, 日本)，傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR，型号：AVATAR360，Nicolet公司，美国)，荧光光谱仪(型号：RF-5301 PC，岛津公司，日本)，台式高速离心机(Eppendorf公司，德国)，马弗炉(型号：JKKZ4-10，济南精密科学仪器仪表有限公司)，透射电子显微镜(TEM, 型号：JEM-2100F，日本)，酶标仪(Bio-TEK公司，美国)。

称取0.5 g葡萄糖酸锌溶解于10 mL去离子水中，搅拌均匀。将液体转移入25 mL聚四氟乙烯反应釜中，拧紧釜盖，装入不锈钢釜壳中，置于马弗炉中，在200℃条件下水热反应6 h。然后自然冷却至室温，采用0.22 μm滤器过滤反应釜中液体，采用去离子水渗析48 h，渗析液每6 h更换1次，得到Zn-CDs样本, 后续实验待用。

在1 mLZn-CDs溶液中加入9 mL去离子水，充分溶解稀释。在V3超薄碳网(直径为3 mm)上滴加10 μL上述稀释溶液。待自然晾干后，采用TEM观察Zn-CDs的尺寸、形貌，并通过Nano Measurer软件计算Zn-CDs粒径大小及分布。

在石英比色皿中加入0.5 mLZn-CDs溶液，加入去离子水稀释，直至有效测定浓度，设置扫描范围为220~750 nm荧光发射光谱，扫描速度为1 200 nm·min^-1，狭缝宽度为5.5 nm，扫描获取样品的荧光光谱。

在玛瑙研钵中加入适量溴化钾粉末，滴入1滴Zn-CDs溶液，待烘干后快速研磨至极细的粉末，采用模具加压制成均匀透明薄片，进行红外光谱测试(400 cm^－1~4 000 cm^-1波段)，通过傅立叶变换得到样品红外光谱图。

复苏MC3T3-E1细胞，从液氮中取出装有MC3T3-E1细胞的冻存管，迅速将其置入37℃水浴锅中，轻摇直至融化。在超净台内取1个离心管，加入3 mL含10%胎牛血清(FBS)和1%青-链双抗的HG-DMEM培养基。采用移液器将冻存管内液体吸入离心管，1 500 r·min^-1离心3 min，弃去上清，加入4 mL完全培养基，置于37℃、5%CO₂孵箱培养，次日换液；待细胞达到80%~90%融合时，PBS溶液冲洗细胞2次，胰蛋白酶消化细胞，约30 s后，加入2 mL含血清培养基终止消化，移入离心管，1 500 r·min^-1离心3 min，弃上清，加入适量培养基，传代培养，每3 d更换培养液，待后续实验。

取复苏后3代ME3T3-E1细胞，PBS冲洗2次，0.25%胰酶消化，离心，采用培养基重悬细胞，细胞计数，以每孔5×10³个细胞转至96孔细胞培养板，在37℃、5%CO₂孵箱中培养24 h；空白对照组只加入细胞培养液，实验组加入不同浓度(0.01、0.10、1.00、10.00、100.00和1 000.00 mg·L^-1)Zn-CDs，每个浓度设置3个复孔，每孔加入培养液100 μL，37℃、5%CO₂孵箱共培养24 h, 每孔加入5 g· L^-1 MTT溶液20 μL，置于37℃、5%CO₂条件下培养4 h，使其形成蓝紫色甲瓒结晶体；然后吸出孔内培养液，每孔加入150 μL DMSO，振荡溶解10 min, 在酶标检测仪490 nm波长处测定其吸光度(A)值。RGR=(实验组A值/空白对照组A值)×100%。

取对数生长期MC3T3-E1细胞(1×10⁵个)于共聚焦皿中，37℃、5%CO₂条件下共培养24 h，弃液，加入含碳点浓度为100 mg·L^-1培养液。培养24 h后，吸出培养液，PBS冲洗3次，加入1 mL 10%甲醛固定15 min，吸出固定液，PBS冲洗3次，于共聚焦皿中加入1 mL PBS溶液，采用共聚焦显微镜分别在405、488和532 nm激发波长下观察蓝色荧光、绿色荧光和红色荧光中细胞成像特点。

将实验分为空白对照组和不同浓度(0.01、0.10、1.00、10.00和100.00 mg· L^-1) Zn-CDs组。各组均采用成骨诱导液(含10 mmol· L^-1 β-甘油磷酸钠、100 nmol·L^-1地塞米松和50 mg· L^-1抗坏血酸)诱导，每3 d更换1次。应用RNA提取试剂盒分别于诱导第3和7天提取细胞总RNA, 采用NanoDrop 1000 spectrophotometer检测所提取RNA浓度。按照PrimerScript^® RT Reagent Kit说明书将所提取RNA逆转录为cDNA, 最后采用qRT-PCR检测MC3T3-E1细胞中成骨分化标志Runt相关转录因子2(Runt-relateed transcription factor-2，Runx2)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和骨钙素(osteocalcin，OC)的mRNA表达水平(β-actin为内参)。引物序列见表 1，具体操作按照试剂盒说明书进行。采用2^－ΔΔCt方法计算MC3T3-E1细胞中Runx2、ALP和OCmRNA相对表达水平。

将实验分为空白对照组和不同浓度(0.01、0.10、1.00、10.00和100.00 mg· L^-1) Zn-CDs组。选取复苏后第3代MC3T3-E1细胞，以每孔1×10⁵个细胞接种于12孔板。24 h后当细胞生长达80%~90%融合时，分别更换培养液为上述不同浓度Zn-CDs浸提液，每3 d更换1次，培养21 d后，弃去培养液，PBS冲洗2次，每孔加入预冷的95%乙醇，4℃固定10 min, 三蒸水冲洗2次，每孔加入0.5 mL 1%茜素红溶液，37℃、30 min后，三蒸水轻轻冲洗至浮色消失，干燥后镜下观察染色结果。如有红色云雾点状出现，则说明钙化染色成功。

采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。Zn-CDs的RGR和MC3T3-E1细胞中Runx2、ALP及OC mRNA相对表达水平以x±s表示，组间样本均数比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

TEM下Zn-CDs为粒径大小均匀的球形颗粒，分散度较好(图 1)。随机选取50个Zn-CDs，通过Nano Measurer软件计算直径，其粒径约为5.25 nm。高分辨TEM(HRTEM)下可见Zn-CDs具有晶格条纹，晶格间距为0.20 nm，与石墨结构晶格间距相近。

图 1 Zn-CDs的TEM (A)和HRTEM(B)观察结果 Fig. 1 Observation results of TEM (A) and HRTEM (B) ofZn-CDs

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Zn-CDs的具体荧光光谱图见图 2(插页二)，其中300~400 nm代表对应的激发波长，每一条激发波长光谱在横坐标上具有其相对应的发射波长。当激发波长为360 nm时，Zn-CDs溶液具有最佳发射效果，发射波长为450 nm。在不同的激发波长下，Zn-CDs表现出激发依赖性，可以呈现不同的颜色。

图 2 Zn-CDs的荧光光谱 Fig. 2 Fluorescence spectra of Zn-CDs

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Zn-CDs表面还有大量的羟基和羧基官能团，3 500 cm^-1左右对应O-H的伸缩振动峰，1 500 cm^-1左右对应C=O的振动峰，1 000 cm^-1左右对应C-O的伸缩振动峰，这些基团赋予了Zn-CDs良好的水溶性和进一步表面修饰的可能性，使其在生物医学领域将具有更好的应用前景。Zn-CDs的FT-IR谱见图 3。

图 3 Zn-CDs的FT-IR谱 Fig. 3 FT-IR spectra of Zn-CDs

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倒置荧光显微镜观察，培养24 h后MC3T3-E1细胞贴壁生长，呈现梭形或多角形。见图 4。

图 4 倒置荧光显微镜下MC3T3-E1细胞形态(Bar=50 μm) Fig. 4 Morphology of MC3T3-E1 cells observed under inverted fluorescence microscope (Bar=50 μm)

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将Zn-CDs与细胞共培养24 h后，随着Zn-CDs浓度的增加，A值和RGR均有所减少。当Zn-CDs浓度低于100.00 mg·L^-1时，其无明显细胞毒性。与空白对照组比较，1 000.00 mg· L^-1Zn-CDs组MC3T3-E1细胞的RGR明显降低(P < 0.01)，表明Zn-CDs浓度小于100.00mg·L^-1时无明显细胞毒性。见图 5。

1:Blank control group; 2-7:0.01, 0.10, 1.00, 10.00, 100.00 and 1 000.00 mg·L-1 Zn-CDs groups. *P < 0. 05, * *P < 0.01 compared with blank control group. 图 5 各组ME3T3-E1细胞的RGR Fig. 5 RGR of ME3T3-E1 cells in various groups

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MC3T3-E1细胞与Zn-CDs共培养24 h后共聚焦显微镜成像结果：MC3T3-E1细胞呈梭形，有较大的细胞核。在不同激发波长下，MC3T3-E1细胞可以呈现不同颜色的荧光，细胞轮廓清楚且荧光强度细胞质比细胞核强。另外荧光强度稳定，表明Zn-CDs能够荧光标记MC3T3-E1细胞。见图 6(插页二)。

A: 405 nm excitation; B: 488 nm excitation; C: 532 nm excitation. 图 6 MC3T3-E1细胞与Zn-CDs激光共聚焦成像图（×100） Fig. 6 Laser confocal images of MC3T3-E1 cells and Zn-CDs (×100)

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诱导第3和7天时，各剂量Zn-CDs组MC3T3-E1细胞中Runx2、ALP和OCmRNA表达水平呈剂量依赖性增加的趋势。诱导第3天时，0.01mg·L^-1 Zn-CDs组MC3T3-E1细胞中OC mRNA相对表达水平与空白对照组比较未见明显升高，而其他浓度Zn-CDs组其水平明显升高(P<0.05)。诱导第7天时0.01 mg·L^-1Zn-CDs组MC3T3-E1细胞中OCmRNA相对表达水平升高，约是第3天的2倍。与诱导第3天比较，诱导第7天0.01 mg·L^-1Zn-CDs组MC3T3-E1细胞中Runx 2 mRNA相对表达水平明显降低(P < 0.05)，且诱导第7天相对表达水平约是诱导第3天的1/5。与诱导第3天比较，诱导第7天时0.01 mg·L^-1Zn-CDs组MC3T3-E1细胞中ALP mRNA的相对表达水平明显升高(P < 0.05)。培养21 d后，茜素红染色结果显示：Zn-CDs组MC3T3-E1细胞中钙化结节数多于对照组，与基因结果趋势一致，钙化结节数随Zn-CDs浓度的增加呈增加趋势。见图 7和8(插页二)。

*P < 0.05, * *P < 0.01 compared with blank control group; △P < 0.05 compared with 3 d. 图 7 诱导第3和7天时后各组ME3T3-E1细胞中Runx2 (A)、ALP (B)和OC (C) mRNA相对表达水平 Fig. 7 Relative expression levels of Runx2 (A), ALP (B), and OC (C) mRNA in ME3T3-E1 cells on 3rd and 7th days after induction

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图 8 共培养21d后各组ME3T3-E1细胞形态表现（茜素红，×100） Fig. 8 Morphology of ME3T3-E1 cells in various groups 21 d after co-culture(Alizarin red, ×100)

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由创伤、肿瘤和感染导致的骨缺损通常需要外科手术治疗。目前，骨移植(包括自体骨移植、异体骨移植和异种骨移植)已被广泛应用于修复骨缺损。但传统的骨移植存在供体骨供不应求、免疫抑制反应和骨瓣移植以及继发感染等缺点，限制了其在骨缺损修复中的应用^[10]。骨组织工程技术在促进骨损伤的修复与再生方面显示出巨大的潜力。CDs是一种具有良好生物安全性的生物纳米级材料，因此引起了研究人员的广泛关注，其作为发光纳米粒子在生物医学方面应用中显示出巨大的潜力^[11]。CDs的毒性较低、合成方法多样且简单、经济成本低等为其应用的优势^[12-15]。本实验采用水热法合成Zn-CDs，首先观察检测合成的Zn-CDs表征，其光学性能显示出优异的荧光标记成像能力。本文作者采用合成的Zn-CDs与细胞共培养诱导前成骨细胞成骨向分化，结果显示：Zn-CDs对MC3T3-E1细胞具有较好的促成骨作用。

小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1是由新生小鼠颅盖骨细胞建株, 在体外培养中具有成骨细胞的表型特征。KIM等^[1]通过敲除siRNA，探讨其对MC3T3-E1细胞的作用，研究金雀异黄素对骨分化的影响，将MC3T3-E1细胞作为一个良好的研究成骨细胞分化的模型。本实验选择MC3T3-E1细胞，研究Zn-CDs对其成骨分化的作用。本文作者首先采用MTT法检测Zn-CDs细胞毒性，结果表明：随着Zn-CDs浓度的增加，与低浓度Zn-CDs共培养后，MC3T3-E1细胞无明显细胞毒性，表明其有良好的生物安全性；其次，测定细胞中不同分化阶段成骨相关标志物Runx2、ALP和OCmRNA相对表达水平。成骨细胞的分化过程包括增殖、细胞外基质沉积、基质成熟和矿化。Runx 2又称核心结合因子a1 (Cbfa1), 是成骨细胞分化的早期标志物，其表达是成骨细胞分化的先决条件^[16-18]。作为成骨细胞分化的全过程的调控中枢，其基因结合位点位于OC等基因的启动子上，调节生长因子或细胞外基质基因表达。YANG等^[17]研究显示：PHF20通过改变Runx2和Runx2启动子区组蛋白甲基化水平来调节成骨细胞分化。本实验中采用不同浓度Zn-CDs与MC3T3-E1细胞共培养, 诱导第3天时MC3T3-E1细胞中Runx2、ALP和OC mRNA相对表达水平均高于空白对照组，其中Runx2mRNA相对表达水平较高，ALP mRNA次之，而OC mRNA的相对表达水平最低，符合成骨细胞早期分化的特点。

ALP是成骨细胞表达的主要酶，其特异性地水解有机磷酸盐形成羟基磷灰石结晶，其表达随着细胞分化而增强，可用来评价骨发生^[19]。本实验结果显示：诱导第3和7天时ALPmRNA相对表达水平逐渐升高，表明Zn-CDs对MC3T3-E1细胞有较好的促成骨分化作用。OC是一种主要由成骨细胞合成的蛋白质，与骨性矿化物有很强的结合能力。POUNDARIK等^[20]通过对比骨桥蛋白(OPN)研究显示：OC在矿化过程中控制着晶体的生长，在骨的物理特性(如矿物质厚度)调节中发挥重要作用。OC被认为是成骨分化的晚期标志物^{[16, 21]}。在Zn-CDs刺激下，诱导第3天时MC3T3-E1细胞中OC mRNA相对表达水平并未升高，而诱导第7天时其表达水平升高，表明Zn-CDs在成骨细胞分化晚期仍具有促成骨作用。茜素红染色是对成骨细胞泌钙能力的检测。本实验结果显示：培养21 d时茜素红染色结果显示：各浓度Zn-CDs均促进钙盐沉积，表明Zn-CDs具有促进成骨细胞矿化的能力。

综上所述，Zn-CDs具有细胞成像和促进小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1向成骨方向分化双重功能。