近年来，病毒、酒精、高脂肪和长期服用药物等多种因素均是造成肝损伤(liver damage，LD)和肝硬化的重要原因，目前肝脏疾病的发生率呈现升高趋势^[1-2]，因此有关急性和慢性肝脏疾病的研究成为近年的热点和前沿。上述这些因素均会造成患者急性肝功能损伤(acute liver damage，ALD)，也是造成急性肝功能衰竭(acute heptic failure, AHF)的主要诱因，甚至可诱发肝部肿瘤的发生^[3-4]。目前，AHF治疗难度较大，患者的病死率较高，预后极差，到目前为止仍无疗效确切的、安全可靠的治疗药物^[5-6]。人参二醇皂苷(panoxadiol saponins，PDS)对急性重症胰腺炎大鼠多脏器具有保护作用，对感染性休克患者具有治疗和保护作用，PDS还具有抗氧化和抗疲劳等作用。蛋白激酶B(protein kinase B, PKB)又称AKT，是细胞增殖、转录和迁移过程中起重要作用的一种丝氨酸/苏氨酸特性蛋白激酶，在肝脏疾病的发生发展中起重要作用。新近的研究^[7-8]也显示：PDS对ALD有治疗作用。为了更好地研究AHF的治疗方法，本实验通过腹腔内注射化学药物四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl₄)制备大鼠ALD模型，给予待测传统中药PDS，观察其对ALD模型大鼠的保护作用，并对其相关炎症机制进行深入研究。

50只SD大鼠，体质量180~220 g，动物合格证号：SCXK(辽) 2007-0009。PDS提取物，本品为淡黄色提取物，经高效液相色谱(HPLC，上海精密仪器仪表公司)测定，纯度达到90%以上，由锦州医学大学实验室自行提纯；白细胞介素12(IL-12)、白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)均购自BOSTER博士德生物制剂有限公司。全自动血生化分析仪(德国罗氏公司ReflotronPlus快速分析仪)，酶标仪(美国Becton dickinson公司)。

受试SD大鼠随机分为5组，每组10只，包括对照组，模型组，低、中和高剂量PDS组。除对照组外，其余各组大鼠分别给予60% CCl₄橄榄油剂3 mL·kg^-1，隔日腹腔注射，共注射3次；对照组大鼠腹腔注射等体积橄榄油^[9-10]。制备ALD模型后，对照组和模型组大鼠每日灌胃给予等体积生理盐水，各剂量PDS组大鼠灌胃给予不同剂量(10、20和40 mg·kg^-1)PDS，给药时程为2周。

给药期间记录各组大鼠外观体征和行为活动，皮毛是否贴身或是否出现稀疏竖散，记录各组大鼠食量、体质量和死亡率。待2周给药结束后，将各组大鼠处死，肉眼观察给药后大鼠的肝脏颜色、大小、光滑度和肝组织韧性。

末次给药24 h后，采用20%乌拉坦全麻各组大鼠，经颈动脉取血2 mL，采用全自动血生化分析仪测定肝功能指标，包括谷氨酸氨基转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)、总胆红素(total bilirubin，TBIL)和总蛋白(total protein，TP)。

取各组大鼠一部分肝脏，制备肝组织匀浆，采用ELISA法于酶标仪530 nm波长处测定吸光度(A)值，半定量法检测各组大鼠各炎症因子的水平，包括IL-12、IL-6和TNF-α水平。

AKT和磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)蛋白相对表达水平采用AKT测定试剂盒，按照试剂盒说明书于96孔板内进行梯度加样，制备分离胶与浓缩胶，采用Bio-Rad电泳仪进行SDS-PAGE凝胶电泳，采用湿法转膜。分别加入AKT、p-AKT和β-actin，ECL试剂法显色。采用Image Quant LAS 4000凝胶成像系统获得扫描图像后Image J软件分析条带灰度值，计算蛋白相对表达水平。蛋白相对表达水平=各组蛋白灰度值/β-actin灰度值。

采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。各组大鼠肝功能指标(ALT、AST、TBIL和TP)，肝组织匀浆中IL-12、IL-6和TNF-α水平以及各组大鼠肝组织中AKT和p-AKT蛋白相对表达水平均以x±s表示。两组样本均数比较采用独立样本t检验，多组样本均数比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

在给药期间，与对照组比较，模型组大鼠活动较少，食量明显减少，体质量呈进行性降低，无抵抗力，尿黄，可见皮肤、黏膜出血，多数大鼠出现腹水。实验结束后，剖取大鼠肝脏大体观察：模型组大鼠肝组织表面粗糙，腹膜粘连，且大鼠肝脏肿大或缩小明显，色黄、易出血。与模型组比较，各剂量PDS组大鼠上述症状明显减轻，损伤情况较轻微。

与对照组比较，模型组和各剂量PND组大鼠肝功能指标中ALT、AST和TBIL水平明显升高(P < 0.01)；与模型组比较，各剂量PDS组大鼠上述指标明显降低(P < 0.01)。与对照组比较，模型组大鼠TP水平明显降低(P < 0.01)；与模型组比较，各剂量PDS组大鼠TP水平明显升高(P < 0.01)。见表 1。

与对照组比较，模型组大鼠肝组织匀浆中IL-12、IL-6和TNF-α水平明显升高(P < 0.01)；与模型组比较，各剂量PDS组大鼠上述炎症因子水平明显降低(P < 0.01)。见表 2。

与对照组比较，模型组大鼠肝组织中AKT蛋白表达水平明显升高(P < 0.01)，而p-AKT蛋白表达水平降低(P < 0.01)；与模型组比较，各剂量PDS组大鼠肝组织中AKT蛋白表达水平降低(P < 0.01)，p-AKT蛋白表达水平升高(P < 0.01)。见图 1和2。

*P < 0.01 compared with control group; △P < 0.01 compared with model group; 1:Control group; 2:Model group; 3:Low dose of PDS group; 4:Middle dose of PDS group; 5:High dose of PND group. 图 1 各组大鼠肝组织中AKT及p-AKT蛋白相对表达水平 Fig. 1 Relative expression levels of AKT and p-AKT proteins in liver tissue of rats in various groups

图选项

Lane 1:Control group; Lane 2:Model group; Lane 3: Low dose of PDS group; Lane 4: Middle dose of PDS group; Lane 5: High dose of PDS group. 图 2 各组大鼠肝组织中AKT和p-AKT蛋白表达电泳图 Fig. 2 Electrophoregram of expressions of AKT and p-AKT proteins in liver tissue of rats in various groups

图选项

目前ALD治疗难度大^[11]，传统中药治疗ALD越来越受到广泛重视。研究^[12]显示：该实验中的待测药物PDS对LD有较好的治疗并逆转LD的作用^[12]。PDS是人参中的主要活性成分，具有良好的抗氧化、增强免疫力和抗内毒素等多种药理学作用^[13]。研究^[14]表明：PDS能抑制肿瘤的浸润与转移，是主要的抗癌活性产物。研究^[15]显示PDS对梗阻性黄疸(obstructive jaundice，OBJ)造成的ALD具有明显的保护作用。本研究结果显示：PDS处理后ALD大鼠一般状态明显改善，大鼠LD症状明显改善，提示PDS对LD有治疗作用。研究^[16]显示：PDS对OBJ大鼠的LD具有保护作用，可改善大鼠肝脏组织病理损伤。

本研究结果显示：PDS能明显减轻CCl₄引起的肝脏损害作用，降低ALT和AST水平，升高TP水平，另外也可以通过降低肝组织中炎症介质IL-12、IL-6及TNF-α水平，发挥其保护作用。研究^[17]显示：IL-12、IL-6和TNF-α参与了多种炎症反应及随后的炎症级联放大过程，可上调肝脏细胞表面炎症成分和炎症效应，引起相关炎症反应的发生，最终可能诱发AHF。本研究中，各剂量PDS均能明显降低上述炎症因子水平，提示PDS在肝脏疾病中发挥治疗及保护作用。研究^[18]显示：PDS对OBJ大鼠LD的保护作用是通过降低氧自由基和炎症因子水平而实现的。XIAO等^[19]发现：PDS抗大鼠急性重症胰腺炎中肝脏损伤是通过影响核因子κB(NF-κB)而实现的。研究^[20]显示：PDS具有与地塞米松类似的抗炎作用，可通过抑制NF-κB信号通路的活化，进而减少TNF-α和IL-6的产生，上述实验结果在本实验中得到了进一步验证。给予PDS治疗后，大鼠炎症因子IL-12、IL-6和TNF-α水平均降低。本研究结果显示：与对照组比较，PDS组大鼠肝脏组织中AKT蛋白表达水平降低。AKT是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，在多种细胞和组织的生理以及病理活动中发挥作用，并且可能在肝脏疾病和肝肿瘤中呈高表达^[21]。研究^[22-23]显示：PDS具有抑制内毒素休克大鼠IL-18表达的作用，进而抑制内毒素诱导的PKB信号转导通路的激活。本研究结果显示：PDS可能通过抑制炎症因子表达，继而影响p-AKT-AKT信号通路蛋白表达，在治疗及预防肝脏疾病中发挥重要作用。

综上所述，PDS具有明显的肝保护作用，该作用可能通过其下调多种炎症因子水平，继而通过影响p-AKT-AKT信号通路发挥其治疗和保护作用。PDS将有可能成为一种较理想的肝病治疗药物。