胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，具有发病率高和生存率低的特点，目前寻求分子靶点治疗成为胶质瘤新的突破点^[1]。同源异型盒基因(homeobox gene HOX)作为转录调节因子在肿瘤细胞增殖分化过程中起到重要的调控作用^[2]，同源异型盒基因A4(homeobox gene A4, HOXA4)作为HOX家族一员，在肺癌、结肠癌和卵巢癌等不同肿瘤中表达异常并发挥调控作用^[3-5]。研究^[6]显示：在胚胎干细胞生长发育过程中，HOXA4可作用于Wnt/β-catenin信号通路，同时最新研究^[7]显示：在肺癌组织中HOXA4可通过调控Wnt/β-catenin信号通路影响肿瘤的生长和侵袭。本课题组前期体外研究^[8]显示：人胶质瘤组织中HOXA4基因表达上调并促进细胞增殖、抑制凋亡从而发挥促癌作用，但是否存在HOXA4通过Wnt/β-catenin信号通路影响胶质瘤恶性生物学行为尚未清楚。本研究通过建立人胶质瘤HOXA4基因敲除荷瘤裸鼠模型，进一步探讨HOXA4对胶质瘤细胞体内生长的影响及其对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用。

TRIzol试剂和Polyfect-V试剂(Invitrogen公司，美国)，HiFi-MMLV cDNA第1链合成试剂盒和UltraSYBR Mixture(北京康为世纪生物技术公司)，DMEM高糖培养基和FBS(Gibco公司，美国)，HOXA4 siRNA载体质粒(Vigene公司，美国)，慢病毒包装体系(北京英茂盛业生物科技有限公司)，AxyPrep质粒DNA小量试剂盒(Axygen公司，美国)，HOXA4、CTNNB1和Gsk3β PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)，HOXA4抗体(美国Santa Cruz公司)，β-catenin、Gsk3β、CyclinD1和p53抗体(武汉博士德生物技术公司)。荧光定量PCR仪(Applied Biosystems公司，美国)，倒置光学显微镜(Nikon公司，日本)。

人胶质瘤U251细胞购于中国科学院上海细胞所，常规培养于DMEM高糖培养基(内含10% FBS、100 U·L^-1青霉素和100 mg·L^-1链霉素)，置于37℃、5% CO₂培养箱中。HOXA4 siRNA载体质粒和阴性对照质粒转化E.coil TG1感受态细胞后进行质粒扩增，小剂量提取质粒DNA后按照慢病毒包装体系操作对U251细胞进行Polyfect-V转染。48~72 h后观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况，感染率=(表达GFP的细胞数/总细胞数)× 100%，感染率大于90%即为成功建立稳转细胞。U251细胞稳转HOXA4 siRNA后命名为si-HOXA4，U251细胞稳转阴性对照后命名为si-NC。si-HOXA4上游引物：5′-CGCCCGCCTACACCCGGCAGCACTCGAGTGCTGCCGGGTGTAG- GCGGTTTTTTA-3′；下游引物：5′-CGCGTAA- AAAACCGCCTACACCCGGCAGCACTCGAGT- GCTGCCGGGTGTAGGCGGGCGAT-3′。

9只4~6周龄雌性BALB/c裸鼠购于中国上海斯莱克实验动物有限公司，SPF级。取对数生长期U251、si-NC和si-HOXA4细胞，将细胞用灭菌PBS重悬浮，使细胞密度为1×10⁷ mL^-1，采用1 mL注射器细胞吸取100 μL细胞悬液，分别接种于裸鼠颈背部皮下，每种细胞接种3只裸鼠并分组命名为对照组、si-NC组和si-HOXA4组。每3~4 d观察裸鼠肿瘤生长情况，并使用游标卡尺测量肿瘤的体积，肿瘤体积=(长×宽²)/2。培养21 d后荷瘤裸鼠断颈处死，剥离颈背部皮下肿瘤组织，肿瘤称质量。部分肿瘤组织置于液氮中保存用于RNA检测，部分组织以甲醛固定后用于蛋白检测。

TRIzol试剂一步法提取组织总RNA，以该RNA为模板使用HiFi-MMLV cDNA第1链合成试剂盒将RNA逆转录为cDNA，对cDNA进行qRT-PCR检测，反应条件为95℃、10 min，95℃、15 s，58℃、30 s，72℃、30 s，共40个循环，结果计算采用2^-ΔΔCt方法。内参管家基因为β-actin。HOXA4上游引物：5′-GATAAACTCCAACTACATCG-3′，HOXA4下游引物：5′-GTAGTAGGAGGCAGTGGGCT-3′；CTNNB1上游引物：5′-GGAATGAAGGCGTGGCAACAT- AC-3′，CTNNB1下游引物：5′-GGCGATATCCAAGGGCTTCTCC-3′；Gsk3β上游引物：5′-AT GCCACAGCAGCGTCAG-3′，GSK3β下游引物e：5′-GGTCTGTCCACGGTCTCC-3′；β-actin上游引物：5′ -GGCACCACACCTTCTACAAT-3′，β-actin下游引物：5′-GTGGTGGTGAAGCTGT- AGCC-3′。

Wnt/β-catenin信号道路相关蛋白(HOXA4、β-catenin、Gsk3β、CyclinD1和P53蛋白)表达水平3~4 μm石蜡切片经65℃烤片2 h后，以二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，3%过氧化氢浸泡阻断内源性过氧化物酶，柠檬酸高压修复，切片放湿盒内加入一抗孵育45 min，PBS洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育30 min，DAB显色，苏木素复染。采用ImagePro Plus 6.0软件检测蛋白平均吸光度(A)值，以A值代表各种蛋白表达水平。

采用GraphPad Prism 5.0软件绘制统计图。采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。各组裸鼠肿瘤体积和质量，各组裸鼠肿瘤组织中HOXA4、CTNNB1和Gsk3β mRNA相对表达量，各组裸鼠肿瘤组织中HOXA4、β-catenin、Gsk3β、CyclinD1和P53蛋白表达水平以x ±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

HOXA4 siRNA载体质粒和阴性对照质粒经慢病毒转染至U251细胞后，si-HOXA4和si-NC细胞中均有绿色荧光表达，感染率均大于90%。见图 1(插页一)。

图 1 荧光显微镜观察si-HOXA4组（A）和si-NC组（B）细胞中GFP的表达（×200） Fig. 1 Expressions of GFP in cells in si-HOXA4 (A) and si-NC (B) groups observed under fluorescence microscope(×200)

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裸鼠颈背部皮下注射U251、si-NC和si-HOXA4细胞，人胶质瘤荷瘤裸鼠均成活并在注射后5 d可见瘤体形成。见图 2(插页一)。注射后11和14 d si-HOXA4组裸鼠肿瘤体积较si-NC组减小，但组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；注射后17d，si-HOXA4组裸鼠肿瘤体积[(1.13±0.29)cm³]明显小于si-NC组[(1.94±0.16)cm³](P < 0.05)。注射后21dsi-HOXA4组裸鼠肿瘤体积[(1.65±0.42)cm³]、肿瘤质量[(2.20±0.69)g]明显小于对照组[(4.23±0.72)cm³、(5.71±0.57)g]和si-NC组[(3.67± 0.88)cm³、(5.09±0.73)g] (P < 0.05)。见图 3和4。

图 2 3组荷瘤裸鼠肿瘤组织形态表现（Bar=3cm） Fig. 2 Morphology of tumor tissue of nude mice in three groups(Bar= 3 cm)

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* P < 0.05 vs si-NC group; △P < 0.05 vs control group. 图 3 3组裸鼠肿瘤生长曲线 Fig. 3 Tumor growth curves of nude mice in three groups

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* P < 0.05 vs si-NC group; △P < 0.05 vs control group. 图 4 注射后21 d时3组裸鼠肿瘤质量 Fig. 4 Tumor weights of nude mice in three groups 21 dafter injection

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si-HOXA4组裸鼠肿瘤组织中HOXA4、CTNNB1和Gsk3β mRNA相对表达量分别为0.31±0.04、0.49±0.11和1.06±0.12;与si-NC组比较，si-HOXA4组裸鼠肿瘤组织中HOXA4和CTNNB1相对表达量明显降低(P < 0.05)，而Gsk3β相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图 5。

*P < 0.05 vs si-NC group. 图 5 3组裸鼠肿瘤组织中HOXA4、CTNNB1和Gsk3β mRNA相对表达量 Fig. 5 Relative expression amounts of HOXA4, CTNNB1 and Gsk3β mRNA in tumor tissue of nude mice in three groups

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与si-NC组比较，si-HOXA4组裸鼠肿瘤组织中HOXA4、β-catenin和CyclinD1表达水平明显降低(P < 0.05)，而Gsk3β和P53蛋白表达水平升高(P < 0.05)。见图 6。IHC法检测3组裸鼠肿瘤组织中Wnt/β-catemin信号通路蛋白表达见图 7(插页一)。

*P < 0.05 vs si-NC group. 图 6 3组裸鼠肿瘤组织中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达水平 Fig. 6 Expression levels of Wnt/β-catenin signaling pathway-related proteins in tumor tissue of nude mice in three groups

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图 7 3组荷瘤裸鼠肿瘤组织中Wnt/B-catenin信号通路相关蛋白的表达（免疫组织化学，×100） Fig. 7 Expressions of proteins related to W nt/ β catenin signaling pathway in tumorr tissue of nudein three mice groups(Immunohistochemistry, ×100)

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胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，由于侵袭性高、增殖速度快，使得全切手术困难；其对化疗药物替莫唑胺的耐药性致使患者预后差、复发率高，严重影响患者的生存质量和生存期^{[1, 9]}。随着分子病理学和影像学^[10]的发展，研究者们更深入地理解与胶质瘤发生发展相关的基因和信号通路，进一步发掘适宜的靶点基因，并在此基础上开拓胶质瘤诊治的新策略。HOX基因含有可编码同源结构域的高度保守序列，编码螺旋-转角-螺旋结构的蛋白产物，其可作为转录调节因子与靶基因DNA序列特异性结合起调控作用^[11-12]，HOXA9^[13]、HOXA13^[14]、HOXC11^[15]和HOXD8^[16]异常表达与胶质瘤的发生发展密切相关。本课题组前期研究^[8]显示：HOXA4在人胶质瘤组织中通过影响细胞增殖、克隆、周期、凋亡率和侵袭能力发挥致瘤性。本实验通过慢病毒转染建立荷瘤裸鼠模型并对HOXA4在体内的作用进行了研究，发现HOXA4低表达能够明显抑制肿瘤的生长。Wnt/β-catenin信号通路作为一种在进化中高度保守的信号通路，在胚胎发育过程中对细胞的分化起决定性作用，并且在成熟细胞的多种生理进程中也起到至关重要的影响作用。Wnt/β-catenin信号通路的异常调节可导致多种疾病，在包括胶质瘤在内多种肿瘤的发生发展中起作用^[17]。经典Wnt/β-catenin信号通路中Wnt分泌蛋白通过Frizzled家族跨膜受体蛋白和Dsh/Dvl松散蛋白将信号传至Gsk3β，Gsk3β磷酸化后导致“APC-Axin-Gsk3β复合物”无法形成，阻断了β-catenin蛋白的降解，β-catenin蛋白胞质内聚集并进入核内，与TCF/LEF结合后可调控靶基因发挥生物学作用^[18]。本研究证明HOXA4通过转录调控作用上调β-catenin蛋白的表达水平从而激活Wnt信号通路。另一个信号关键蛋白Gsk3β表达水平在HOXA4表达抑制后升高，但其mRNA表达水平未见异常，原因考虑为HOXA4表达抑制后β-catenin蛋白表达下降反馈于“APC-Axin-Gsk3β复合物”的合成，导致游离Gsk3β蛋白表达水平升高，佐证HOXA4调控机制未作用于Wnt/β-catenin信号通路Gsk3β蛋白。而在Wnt/β-catenin信号通路下游研究^[19]中发现β-catenin与TCF/LEF结合形成复合物后可作用于CyclinD1启动子，导致CyclinD1表达上调。CyclinD1作为细胞周期基因，其主要功能是促进细胞增殖。本文作者发现HOXA4表达抑制后，CyclinD1蛋白表达水平降低，提示CyclinD1基因参与了胶质瘤HOXA4表达下降后细胞增殖和周期阻滞作用。研究^[20]显示：p53作为Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因，可通过促进细胞凋亡在不同肿瘤中发挥作用，而且p53已明确参与胶质瘤的发病并可作为胶质瘤基因诊断依据。本研究结果显示：HOXA4表达抑制后P53蛋白表达水平升高，提示p53基因参与了胶质瘤HOXA4表达异常后的促癌作用。

综上所述，抑制HOXA4的表达可在体内通过Wnt/β-catenin信号通路调控CyclinD1和P53的表达，从而抑制人胶质瘤荷瘤裸鼠肿瘤的生长。