2019, Vol. 45扩展功能
文章信息
- 王鹤龄, 齐华, 李保胜, 蔡青, 全旭, 许彤彤, 崔云霞, 孟维艳
- 非标准D-氨基酸对细菌生物膜抑制作用的研究进展
- Research progress in inhibitory effects of non-canonical D-amino acids on bacterial biofilm
- 吉林大学学报(医学版), 2019, 45(02): 445-449
- Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2019, 45(02): 445-449
- 10.13481/j.1671-587x.20190242
-
文章历史
- 收稿日期: 2018-05-11
2. 吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室, 吉林 长春 130021;
3. 山东省烟台市口腔医院种植中心, 山东 烟台 264000
在自然界中存在互为手性分子的L-氨基酸和D-氨基酸。D-氨基酸又被称为非天然氨基酸，在医药、环境和食品等领域中起着重要的作用。D-氨基酸在真核与原核生物中均起到重要作用。绝大多数情况下，在细菌体内D-氨基酸是通过消旋酶和差向异构酶催化L-氨基酸[1]，使L-氨基酸的α-碳原子发生空间构像的改变。与L-氨基酸不同，D-氨基酸不用于核糖体的蛋白质合成，在细菌体内，D-氨基酸主要参与细胞壁的合成[2-3]。其中，D-丙氨酸和D-谷氨酸更是细菌细胞壁肽聚糖的直接组成成分[1]。区别于此，在细菌生长的稳定期产生并释放的、并非通常意义上合成细胞壁肽聚糖的D-氨基酸称为非标准D-氨基酸[4]。
几乎所有细菌均会在细胞膜外分泌形成细胞壁。细胞壁作为一层网状的弹性结构强有力地对抗着外界压力、维持细胞形态，并作为细菌抵御物理、化学和生物学威胁的有效屏障[5-6]。肽聚糖作为细菌细胞壁的主要组成成分，是由多糖链通过含有D-氨基酸的短肽链交联而成的强而有弹性的聚合物。细菌主要以浮游型和生物膜型2种形式存在，以生物膜形式存在的细菌抗药性远远高于浮游型细菌[7]。人体中由细菌引起的疾病以生物膜形式多见，约占80%以上[8]。在口腔种植体周围，细菌通过次序黏附定植在种植体表面组成了结构复杂的生物膜群体，使细菌的耐药性大大增加。种植体周围炎导致种植失败的病例占失败总数的30%以上[9-10]。种植体颈部细菌的聚集和菌斑生物膜的形成是种植体周围炎形成的始动因素。牙周疾病是牙周组织和牙槽骨丧失的一种慢性炎症性疾病，是人类最常见的感染性疾病之一[11]，牙龈卟啉单胞菌等细菌的定植及生物膜的形成是其主要的致病因素之一。目前，局部应用抗生素仍是临床上针对口腔炎症感染性疾病的主要治疗方法。但长期应用抗生素易导致某些菌株产生抗生素耐药性[12]。与生物膜有关的细菌对抗生素等药物的敏感性较差，并且由于生物膜对环境压力具有一定的抵抗力及其多重耐药性，生物膜相关感染极难治疗[13-15]。
1 非标准D-氨基酸对细菌生物膜的作用 1.1 生理性非标准D-氨基酸对生物膜的作用细菌生物膜是自身产生的胞外基质聚集而成的细胞集群，主要由蛋白质、胞外多糖和DNA共同组成。细菌生物膜的形成具有明显的适应环境改变的作用[16]。近年来D-氨基酸与细菌及生物膜之间的关系受到学者广泛关注。多种革兰阴性菌和革兰阳性菌均可产生非标准D-氨基酸，并将其释放到细胞外培养基中。HOCHBAUM等[17]从金黄色葡萄球菌(革兰阳性菌)生物膜裂解期的上清液中分离出了某些非标准D-氨基酸，主要为D-苯丙氨酸、D-脯氨酸和D-酪氨酸，而只有在金黄色葡萄球菌进入稳定期后才会产生非标准D-氨基酸。HEITZ-MAYFIELD等[10]发现：以霍乱弧菌(革兰阴性菌)为研究对象：非标准D-氨基酸由BsrV(1种周质广谱消旋酶)产生。在细菌生长达到稳定期前浓度极低，而在细菌生长达到稳定期后非标准D-氨基酸在培养液上清中积聚，最终可达到1.0 mmol·L-1，并维持在这一浓度，而正是上清液中非标准D-氨基酸的产生促使了生物膜的裂解。此外，变形链球菌[18]、铜绿假单胞菌[19]和表皮葡萄球菌[20]均具有与金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌相似的生物学现象。上述结果说明无论是在革兰阳性菌还是革兰阴性菌中，非标准D-氨基酸的产生均是细菌生物膜裂解的重要天然信号。
1.2 外源性非标准D-氨基酸对生物膜的作用细菌生物膜作为细胞的机构化群落，其被封闭在胞外基质内，以利于细菌在表面结构的黏附[21]。细菌产生的某些信号分子作为生物膜分散剂促使已成熟的生物膜裂解，有望成为治疗生物膜相关感染的药物。而非标准D-氨基酸作为胞外基质的组分，导致相关蛋白质的释放从而介导生物膜的裂解[21]，外源性D-氨基酸很可能是一种生物膜分散剂[19, 22]。在细菌培养过程中，外源性非标准D-氨基酸的加入并不会对初期的细菌黏附产生影响，但可明显抑制生物膜的形成。BsrV霍乱弧菌突变菌株[3]是缺乏Vc1312基因的突变菌株，与霍乱弧菌具有相同的生长特性及形态，但在稳定期基本不产生D-氨基酸。在BsrV突变菌株的培养液中外源性加入生理量的D-蛋氨酸时，生物膜的形成同样受到抑制[3]。外源性加入3 mmol·L-1D-酪氨酸或D-氨基酸的混合物可以有效抑制枯草芽孢杆菌生物膜的形成并能够分解已形成的生物膜[19]。外源性D-缬氨酸与牙龈卟啉单胞菌共培养，其不仅能够有效地抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜的形成，在远超生理浓度(100~150 mmol·L-1)时还可影响牙龈卟啉单胞菌的形态[23]。对于铜绿假单胞菌而言，高于5 mmol·L-1的外源性D-酪氨酸对其生物膜形成具有明显的抑制作用而不影响细菌生长，这一效果相对于外源性D-亮氨酸、D-色氨酸和D-甲硫氨酸极为显著[24]。体内外实验[25-26]证实：高于5mmol·L-1的外源性D-苯丙氨酸、D-蛋氨酸、D-脯氨酸和D-色氨酸不仅能够抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成，还能够裂解已形成的生物膜。LI等[16]发现：D-酪氨酸、D-苯丙氨酸和D-脯氨酸分别作用于表皮葡萄球菌时，可明显抑制生物膜的形成，而当3种D-氨基酸共同作用时，对其生物膜形成的抑制作用明显优于单独应用。D-酪氨酸在低浓度范围(5~500 nmol·L-1)和高浓度范围(20~200 μmol·L-1)对革兰阳性菌和革兰阴性菌的生物膜形成均具有明显的抑制作用[27]。虽然非标准D-氨基酸对细菌在表面的初期黏附不产生影响，但D-氨基酸抑制生物膜的形成很可能具有共同的机制。
2 非标准D-氨基酸对细菌生物膜的作用机制 2.1 细菌细胞壁的结构和功能在革兰阴性菌和革兰阳性菌中，细菌细胞壁由肽聚糖聚合物组成，其主要成分是肽聚糖。革兰阳性菌的细胞壁较厚，含有多层肽聚糖和磷壁酸，其中肽聚糖占90%。而革兰阴性菌的细胞壁相对较薄，由革兰阴性菌细胞壁特有的脂多糖以及脂蛋白构成的外膜所包绕的肽聚糖组成。而大多数细菌具有革兰阴性细胞壁结构[28]。
肽聚糖是由青霉素结合蛋白合成并修饰的构成细菌细胞壁的强而有弹性的聚合物，其合成需要很多酶的参与，并主要发生在胞质溶胶和胞外基质两处[29]。肽聚糖由多糖链通过含有D-氨基酸的短肽链交联而成[30-31]。N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸构成双糖单元，是以β-1, 4糖苷键与4或5个氨基酸短肽聚合而成的多层网状大分子结构。肽聚糖中的多糖链在各物种中均相同，而横向短肽链在氨基酸组成上却存在着种间差异[32]，但通常均包括D-氨基酸：D-丙氨酸和D-谷氨酸(或是其酰胺化形式的D-谷氨酰胺)，这些D-氨基酸可以整合到肽聚糖中[5]。D-氨基酸是肽聚糖合成所必需的，若D-氨基酸的合成受阻，会最终导致细胞死亡[33]。
肽聚糖作为细菌重要的细胞壁组成结构，一方面保持了细胞结构的完整性并减少细胞生长过程中的机械和渗透损伤，另一方面能协助细胞的生长、分裂及细菌的鞭毛运动。肽聚糖的化学结构是动态的[34-35]，许多物质均是通过破坏肽聚糖结构或抑制肽聚糖合成从而发挥抑菌或杀菌作用，如溶菌酶作用于N-乙酰胞壁酸，青霉素抑制转肽酶的活性，抑制肽桥形成[3, 36]。而在细菌生长进入稳定期时，肽聚糖经常被修饰[37]。
2.2 非标准D-氨基酸对生物膜的作用机制在霍乱弧菌体内，非标准D-氨基酸由BsrV(一种细胞周质广谱消旋酶)产生。染色体系列分析表明：在其他细菌中也可能存在着能够编码合成非标准D-氨基酸的消旋酶[3]。BsrV霍乱弧菌突变菌株的培养液中外源性加入超生理量的D-蛋氨酸时，可在BsrV霍乱弧菌突变菌株中检测到D-蛋氨酸，且与野生型霍乱弧菌的检测量相近[29]。通过激光共聚焦显微镜观察可见：D-蛋氨酸在稳定期被整合到霍乱弧菌细胞壁的肽聚糖结构上，这可以导致细菌对渗透压的超敏反应和肽聚糖的过量积聚。而枯草芽孢杆菌、粪肠球菌和金黄色葡萄球菌中也有同样的现象，但相关的非标准D-氨基酸并非同样为D-蛋氨酸。在一些不能产生D-氨基酸的细菌中，如大肠杆菌、新月柄杆菌，非标准D-氨基酸同样可以整合到肽聚糖结构中[38]。由此可见，非标准D-氨基酸整合到肽聚糖结构中在细菌界广泛存在，并且与稳定期D-氨基酸的产生并无直接关联，独立于非标准D-氨基酸在细菌体内的生成。
在霍乱弧菌中，非标准D-蛋氨酸通过2种方式整合到肽聚糖结构中：①通过蛋白Ldts[29, 39]介导整合到细胞周质中，取代胞壁肽单体或4-3交联二聚体的第4位点的D-丙氨酸；②在胞质内，细胞质连接酶Ddl、MurF催化第5位点前体的形成，非标准D-氨基酸通过特定的转运蛋白的转运，最终取代第5位点上的D-丙氨酸[19]。非标准D-氨基酸的产生取决于功能性δ因子RopS[29]，1种在细菌稳定期具有活性的δ因子[40]，其作为细菌应激反应的主要控制角色，参与调节与压力反馈相关基因的表达，从而起到抵抗压力，维持细胞形态、细菌细胞代谢和其毒力作用以及溶解的功能。而在细菌生长静止期，Ldts的表达受到RpoS的控制[29]。
即使外源性加入超生理量的D-蛋氨酸，在胞壁肽中并未检测到额外的D-蛋氨酸，说明D-蛋氨酸的整合仅限于肽聚糖上的相应位点[3, 29]。在大肠杆菌和根癌土壤杆菌中，非标准D-氨基酸整合到胞壁肽的第4位点，而在枯草芽孢杆菌中，非标准D-氨基酸整合到细菌胞壁肽的第5位点[31]。PEDRO等[41]证明D-半胱氨酸可以整合到集中细菌的胞壁质中，而D-半胱氨酸介导标记的肽聚糖促进了肽聚糖合成动力学的重要研究[42]。包括D-半胱氨酸在内的非标准D-氨基酸均在很大程度上依赖于Ldts的介导整合到肽聚糖中。但无一种L-氨基酸可以被Ldts介导[43]。非标准D-氨基酸可在稳定期对细菌细胞壁进行重塑[44]。由此可见，非标准D-氨基酸通过整合到细菌细胞壁肽聚糖从而抑制生物膜形成，对于大多数细菌是共同的作用途径。
3 结语非标准D-氨基酸在细菌稳定期产生并释放到胞外基质，从而作为生物膜裂解的一种信号分子。外源性非标准D-氨基酸可有效地抑制多种细菌生物膜的形成，这一作用的实现通过蛋白Ldts介导其整合到细胞壁肽聚糖，取代第4位点D-丙氨酸，和(或)细胞质连接酶Ddl、MurF催化肽聚糖第5位点前体的形成，再通过特定的转运蛋白转运，最终取代第5位点上的D-丙氨酸，从而改变肽聚糖结构并有效地抑制细菌生物膜的形成和(或)裂解已形成的生物膜。目前，临床上仍无一种能够有效清除生物膜的试剂或制剂，非标准D-氨基酸等有望成为预防或治疗生物膜感染性相关疾病的有效制剂。
| [1] | TANNER M E. Understanding nature's strategies for enzyme-catalyzed racemization and epimerization[J]. Cheminform, 2002, 35(4): 237–246. |
| [2] | PJETURSSON B E, ASGEIRSSON A G, ZWAHLEN M, et al. Improvements in implant dentistry over the last decade:comparison of survival and complication rates in older and newer publications[J]. Int J Oral Maxillofac Implants, 2014, 29(Suppl): 308–324. |
| [3] | LAM H, OH D C, CAVA F, et al. D-amino acids govern stationary phase cell wall remodeling in bacteria[J]. Science, 2009, 325(5947): 1552–1555. DOI:10.1126/science.1178123 |
| [4] | CAVA F. Divergent functional roles of D-amino acids secreted by Vibrio cholera[J]. Int Microbiol, 2017, 20(3): 149–150. |
| [5] | HÖLTJE J V. Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli[J]. Microbiol Mol Biol Rev, 1998, 62(1): 181–203. |
| [6] | VOLLMER W, BLANOT D, DE PEDRO M. Peptidoglycan structure and architecture[J]. Fems Microbiol Rev, 2008, 32(2): 149–167. |
| [7] | CAI Y, STRØMME M, MELHUS A, et al. Photocatalytic inactivation of biofilms on bioactive dental adhesives[J]. J Biome Mater Res Part B App Biomater, 2014, 102(1): 62–67. DOI:10.1002/jbm.b.32980 |
| [8] | WOOD T K, HONG S H, MA Q. Engineering biofilm formation and dispersal[J]. Trends Biotechnol, 2011, 29(2): 87–94. DOI:10.1016/j.tibtech.2010.11.001 |
| [9] | PENARROCHA-DIAGO M, BORONAT-LOPEZ A, GARCÍA-MIRA B. Inflammatory implant periapical lesion:etiology, diagnosis, and treatment-presentation of 7 cases[J]. J Oral Maxillofac Surg, 2009, 67(1): 168–173. DOI:10.1016/j.joms.2007.12.022 |
| [10] | HEITZ-MAYFIELD L J A. Peri-implant diseases:diagnosis and risk indicators[J]. J Clin Periodontol, 2010, 35(s8): 292–304. |
| [11] | TAGUCHI Y, SATO K, YUKITAKE H, et al. Involvement of an Skp-like protein, PGN_0300, in the type IX secretion system of Porphyromonas gingivalis[J]. Infec Immun, 2016, 84(1): 230–240. DOI:10.1128/IAI.01308-15 |
| [12] | KULIK E M, WALTIMO T, WEIGER R, et al. Development of resistance of Mutans streptococci and Porphyromonas gingivalis to chlorhexidine digluconate and amine fluoride/stannous fluoride-containing mouthrinses in vitro[J]. Clin Oral Investig, 2015, 19: 1547–1553. DOI:10.1007/s00784-014-1379-y |
| [13] | RUMBO C, VALLEJO J A, CABRAL M P, et al. Assessment of antivirulence activity of several D-amino acids against Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa[J]. J Antimicrob Chemother, 2016, 71: 3473–3481. DOI:10.1093/jac/dkw342 |
| [14] | COSTERTON J W, STEWART P S, GREENBERG E P. Bacterial biofilms:a common cause of persistent infections[J]. Science, 1999, 284(5418): 1318–1322. DOI:10.1126/science.284.5418.1318 |
| [15] | MAH T F, O'TOOLE G A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents[J]. Trends Microbiol, 2001, 9(1): 34–39. |
| [16] | LI H, YE Y, LING N, et al. Inhibitory effects of D-tryptophan on biofilm development by the food-borne Cronobacter sakazakii[J]. Int Dairy J, 2015, 49: 125–129. DOI:10.1016/j.idairyj.2015.05.001 |
| [17] | HOCHBAUM A I, KOLODKIN-GAL I, FOULSTON L, et al. Inhibitory effects of D-amino acids on Staphylococcus aureus biofilm development[J]. J Bacteriol, 2011, 193(20): 5616. DOI:10.1128/JB.05534-11 |
| [18] | CAVA F, LAM H, DE PEDRO M A, et al. Emerging knowledge of regulatory roles of D-amino acids in bacteria[J]. Cell Mol Life Sci, 2011, 68(5): 817–831. DOI:10.1007/s00018-010-0571-8 |
| [19] | KOLODKINGAL I, ROMERO D, CAO S, et al. D-amino acids trigger biofilm disassembly[J]. Science, 2010, 328(5978): 627–629. DOI:10.1126/science.1188628 |
| [20] | RAMÓN-PERÉZ M L, DIAZ-CEDILLO F, IBARRA J A, et al. D-Amino acids inhibit biofilm formation in Staphylococcus epidermidis strains from ocular infections[J]. J Med Microbiol, 2014, 63(10): 1369–1376. |
| [21] | XING S, SUN X, TAYLOR A A, et al. D-amino acids inhibit initial bacterial adhesion:thermodynamic evidence[J]. Biotechnol Bioengineering, 2015, 112(4): 696–704. DOI:10.1002/bit.v112.4 |
| [22] | ROMERO D, VLAMAKIS H, LOSICK R, et al. An accessory protein required for anchoring and assembly of amyloid fibres in B.subtilis biofilms[J]. Mol Microbiol, 2011, 80(5): 1155–1168. DOI:10.1111/mmi.2011.80.issue-5 |
| [23] | QI H, LI B, WANG H, et al. Effects of D-valine on periodontal or peri-implant pathogens:Porphyromonas gingivalis biofilm[J]. J Periodontol, 2018, 89(3): 303–314. DOI:10.1002/jper.2018.89.issue-3 |
| [24] | SHE P, CHEN L, LIU H, et al. The effects of D-Tyrosine combined with amikacin on the biofilms of Pseudomonas aeruginosa[J]. Microbial Pathogen, 2015, 86: 38–44. DOI:10.1016/j.micpath.2015.07.009 |
| [25] | CONNOLLY J P, GOLDSTONE R J, BURGESS K, et al. The host metabolite D-serine contributes to bacterial niche specificity through gene selection[J]. Isme J, 2015, 9(4): 1039–1051. DOI:10.1038/ismej.2014.242 |
| [26] | SANCHEZ J R C J, PRIETO E M, KRUEGER C A, et al. Effects of local delivery of D-amino acids from biofilm-dispersive scaffolds on infection in contaminated rat segmental defects[J]. Biomaterials, 2013, 34(30): 7533–7543. DOI:10.1016/j.biomaterials.2013.06.026 |
| [27] | YU C, LI X, ZHANG N, et al. Inhibition of biofilm formation by D-tyrosine:Effect of bacterial type and D-tyrosine concentration[J]. Water Res, 2016, 92(2): 173–179. |
| [28] | HUGENHOLTZ P. Exploring prokaryotic diversity in the genomic era[J]. Genome Biol, 2002, 3(2): reviews0003.1–0003.8. |
| [29] | CAVA F, DE PEDRO M A, LAM H, et al. Distinct pathways for modification of the bacterial cell wall by non-canonical D-amino acids[J]. EMBO J, 2011, 30(16): 3442–3453. DOI:10.1038/emboj.2011.246 |
| [30] | HEIJENOORT J V. Formation of the glycan chains in the synthesis of bacterial peptidoglycan[J]. Glycobiology, 2001, 11(3): 25R. DOI:10.1093/glycob/11.3.25R |
| [31] | KURU E, HUGHES H V, BROWN P J, et al. Inside Cover:In situ probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids[J]. Angew Chem Int Ed, 2012, 51(50): 12519–12523. DOI:10.1002/anie.201206749 |
| [32] | VOLLMER W, BLANOT D, PEDRO M A D. Peptidoglycan structure and architecture[J]. Fems Microbiol Rev, 2010, 32(2): 149–167. |
| [33] | RADKOV A D, MOE L A. Bacterial synthesis of D-amino acids[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2014, 98: 5363–5374. DOI:10.1007/s00253-014-5726-3 |
| [34] | VOLLMER W, BLANOT D, DE PEDRO M. Peptidoglycan structure and architecture[J]. Fems Microbiol Rev, 2008, 32(2): 149–167. DOI:10.1111/j.1574-6976.2007.00094.x |
| [35] | VOLLMER W, JORIS B, CHARLIER P, et al. Bacterial peptidoglycan (murein) hydrolases[J]. Fems Microbiol Rev, 2008, 32(2): 259–286. |
| [36] | KOCH A L. Bacterial wall as target for attack:past, present, and future research[J]. Clin Microbiol Rev, 2003, 16(4): 673. DOI:10.1128/CMR.16.4.673-687.2003 |
| [37] | NYSTRÖM T. Stationary-phase physiology[J]. Ann Rev Microbiol, 2004, 58(1): 161–181. DOI:10.1146/annurev.micro.58.030603.123818 |
| [38] | MAGNET S, BELLAIS S, DUBOST L, et al. Identification of the L, D-transpeptidases responsible for attachment of the Braun lipoprotein to Escherichia coli peptidoglycan[J]. J Bacteriol, 2007, 189(10): 3927. DOI:10.1128/JB.00084-07 |
| [39] | MAGNET S, DUBOST L, MARIE A, et al. Identification of the L, D-transpeptidases for peptidoglycan cross-linking in Escherichia coli [J]. J Bacteriol, 2008, 190(13): 4782–4785. DOI:10.1128/JB.00025-08 |
| [40] | HENGGE R. The two-component network and the general stress sigma factor RpoS (σS) in Escherichia coli [J]. Adv Exp Med Biol, 2008, 631: 40–53. DOI:10.1007/978-0-387-78885-2 |
| [41] | PEDRO M A D, QUINTELA J C, HÖLTJE J V, et al. Murein segregation in Escherichia coli [J]. J Bacteriol, 1997, 179(9): 2823. DOI:10.1128/jb.179.9.2823-2834.1997 |
| [42] | PEDRO M A D, YOUNG K D, HÖLTJE J V, et al. Branching of Escherichia coli cells arises from multiple sites of inert peptidoglycan[J]. J Bacteriol, 2003, 185(4): 1147. DOI:10.1128/JB.185.4.1147-1152.2003 |
| [43] | MAINARDI J L, FOURGEAUD M, HUGONNET J E, et al. A novel peptidoglycan cross-linking enzyme for a β-lactam-resistant transpeptidation pathway[J]. J Biol Chem, 2005, 280(46): 38146–38152. DOI:10.1074/jbc.M507384200 |
| [44] | SANCHEZ Z, TANI A, KIMBARA K. Extensive reduction of cell viability and enhanced matrix production in Pseudomonas aeruginosa PAO1 flow biofilms treated with a D-amino acid mixture[J]. App Environm Microbiol, 2013, 79(4): 1396–1399. DOI:10.1128/AEM.02911-12 |