2019, Vol. 45扩展功能
文章信息
- 商琰红, 潘禹辰, 贾志芳, 王玥琦, 杨娜, 赵丹, 姜晶
- SHANG Yanhong, PAN Yuchen, JIA Zhifang, WANG Yueqi, YANG Na, ZHAO Dan, JIANG Jing
- miR200家族在乳腺癌患者血浆中表达水平的检测及其临床意义
- Detection of expression levels of miR200 family in plasma of breast cancer patients and its significance
- 吉林大学学报(医学版), 2019, 45(02): 383-388
- Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2019, 45(02): 383-388
- 10.13481/j.1671-587x.20190229
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文章历史
- 收稿日期: 2018-05-30
2. 吉林大学第一医院临床研究部, 吉林 长春 130021
2. Department of Clinical Research, First Hospital, Jilin University, Changchun 130021, China
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤[1-2]，2015年中国乳腺癌的新发人数占女性全部恶性肿瘤发病的15%[3]。乳腺癌的早期诊断和早期治疗可延长患者的生存时间，提高生活质量。微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是由18~25个核苷酸组成的一类非编码RNA。microRNA200(miR200)家族包括miR200a、miR200b、miR200c、miR141和miR429 5个成员，与多种恶性肿瘤的进展和预后有关[4-8]，有可能作为肿瘤治疗的靶点和预后预测的工具。JIA等[9]研究显示乳腺癌细胞中的miR200a可能作为乳腺癌诊断的生物学指标。石峰等[10]发现：乳腺癌组织中miR200b和miR200c水平明显下降，认为其可能参与了乳腺癌的侵袭和转移过程。miR200在外周血中也有表达，但关于其在外周循环中的表达水平与肿瘤关系的研究报道较少。本研究主要测定miR200在乳腺癌患者和正常人外周血中的表达情况，探讨其在乳腺癌诊断、进展和预后预测中的价值。
1 资料与方法 1.1 研究对象选取2009年11月—2012年11月在河北大学附属医院确诊为乳腺癌患者82例(乳腺癌组)，纳入标准为患者需行乳腺癌切除手术，术前未接受放化疗，术后病理诊断为浸润性乳腺癌。收集患者的一般信息、病理诊断和治疗信息。选取同时期于同一医院体检中心进行体检的无乳腺疾病的女性30人为对照组，对照受试对象与乳腺癌组乳腺癌患者年龄分布匹配(±5岁)。所有受试对象均签署知情同意书后纳入研究。本研究方案经河北大学附属医院伦理委员会批准。乳腺癌患者由专业随访员在患者术后第6个月、1年及之后通过电话等方式进行随访，收集患者术后治疗、复发和生存状态等信息。观察终点为乳腺癌引起的死亡。生存时间定义为从手术日期至死亡日期(如果患者死于乳腺癌)，或至末次随访日期(如果患者尚存活)，或至上一次随访日期(如果失访)之间的时间。截止到2017年8月，共随访74例患者，8例患者失访。
1.2 miRNAs提取和定量收集乳腺癌患者术前和对照组受试对象的EDTA抗凝血，离心后分离血浆于-80℃超低温冰箱中储存备用。采用microRNA提取试剂盒提取血浆样本的miRNAs(miRNeasy Serum/Plasma Kit，德国Qiagen公司)。逆转录合成cDNA(miScript Ⅱ RT Kit，德国Qiagen公司)，实时荧光PCR反应监测所有样本中miR200家族成员miR200a、miR200b、miR200c、miR141和miR429的相对表达水平(SYBR GreenPCR Kit，德国Qiagen公司)。考虑到外周血中miRNA的表达水平变异较大，常规用于组织中miRNA表达定量的内参U6不适用于循环miRNAs的定量。因此，本研究采用外加参照方法，在miRNA提取过程中添加人类不表达的线虫微小RNA cel-39，作为miRNA提取、逆转录和定量过程的参照。以上所有miRNAs的引物均购自德国Qiagen公司，所有实验的反应体系、反应条件和操作均按照说明书进行，每个反应重复3次。以ΔCt = Ct cel-39 － CtmiRNA表示血浆标本中miRNAs的相对表达水平，最终结果取3次重复的平均值。
1.3 统计学分析采用SPSS18.0统计软件进行统计学分析。计量资料如年龄和miR200家族表达水平以x±s表示，组间比较采用两独立样本t检验。计数资料如组织学分级、TNM分期等用N(%)来表示。采用受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线评价各血浆miRNAs的诊断价值。采用Cox风险比例模型调整相关影响因素进行生存分析。所有检验均为双侧检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 研究对象的一般特征本研究共纳入乳腺癌患者82例，正常健康对照者30名，全部为女性。乳腺癌组患者平均年龄为(52.27±10.44)岁，对照组受试对象平均年龄为(52.57±9.77)岁。乳腺癌患者TNM分期以Ⅱ期为主(48.8%)，其次分别为Ⅰ期(36.6%)、Ⅲ期(12.2%)和Ⅳ期(2.4%)；66.7%的患者组织学分级为Ⅱ级，31.9%为Ⅲ级，1.4%为Ⅰ级；雌激素受体(estrogen receptor, ER)、孕激素受体(progesterone receptor, PR)和人表皮生长因子受体2(Her-2)为阳性的患者分别占76.8%、68.3%和25.6%。肿瘤类型以导管腺癌为主(93.5%)。93.7%的患者在术后接受了综合治疗。见表 1。
| Characteristic | Value |
| Age (year) | 52.27±10.44 |
| Histological grading | |
| Ⅰ | 1(1.4%) |
| Ⅱ | 48(66.7%) |
| Ⅲ | 23(31.9%) |
| ER | |
| Positive | 63(76.8%) |
| Negative | 19(23.2%) |
| PR | |
| Positive | 56(68.3%) |
| Negative | 26(31.7%) |
| Her-2 | |
| Positive | 21(25.6%) |
| Negative | 61(74.4%) |
| Triple-negative | |
| Positive | 8(9.8%) |
| Negative | 74(90.2%) |
| Tumor type | |
| Ductal adenocarcinoma | 77(93.9%) |
| Other | 5(6.1%) |
| Surgical procedure | |
| Modified radical mastectomy | 67(81.7%) |
| Other | 15(18.3%) |
| Depth of invasion | |
| T1 | 42(51.2%) |
| T2 | 38(46.3%) |
| T3 | 2(2.4%) |
| Lymph node metastasis | |
| N0 | 49(59.8%) |
| N1 | 22(26.8%) |
| N2 | 4(4.9%) |
| N3 | 7(8.5%) |
| Distant metastasis | |
| M0 | 80(97.6%) |
| M1 | 2(2.4%) |
| TNM stage | |
| Ⅰ | 30(36.6%) |
| Ⅱ | 40(48.8%) |
| Ⅲ | 10(12.2%) |
| Ⅳ | 2(2.4%) |
| Postoperative treatment | |
| Yes | 76(93.7%) |
| No | 6(6.3%) |
乳腺癌组与对照组血浆中miR200家族表达水平见表 2。乳腺癌组患者血浆中miR200b表达水平低于对照组(－5.60±2.27 vs －4.30±1.91，P=0.006)，乳腺癌组患者血浆中miR141表达水平低于对照组(－6.73±2.27 vs －5.11±1.56，P < 0.01)，但miR200a、miR200c和miR429表达水平在乳腺癌组和对照组间比较差异无统计学意义(P=0.268，P=0.075，P=0.872)。采用ROC曲线评价miR200b和miR141对乳腺癌的诊断价值，miR200b的ROC曲线下面积(AUC)为0.685(P=0.003)。miR141的AUC为0.717(P < 0.01)。如果联用miR200b和miR141，AUC为0.735(P < 0.001)。见图 1。联用miR141和miR200b准确度增加幅度较小，可能由于miR200b和miR141有较强相关性(Pearson检验：r=0.605，P < 0.01)。
| (x±s) | ||||||
| Group | n | miR200a | miR200b | miR200c | miR141 | miR429 |
| Control | 30 | －5.89±1.93 | －4.30±1.91 | －4.02±1.79 | －5.11±1.56 | －7.52±2.66 |
| Breast cancer | 82 | －6.40±2.23 | －5.60±2.27* | －4.98±2.71 | －6.73±2.27* | －7.41±3.32 |
| *P < 0.01 compared with control group. | ||||||
|
| A：MiR200b; B：miR141; C：Combination use of miR200b and miR141. 图 1 miR200b和miR141的ROC曲线 Fig. 1 ROC curves of miR200b and miR141 |
|
|
乳腺癌患者血浆中miR141表达水平随着TNM分期升高而降低(TNM Ⅰ-Ⅱ期：-6.53±2.17；TNM Ⅲ-Ⅳ期：-7.89±2.56)，但差异无统计学意义(P=0.055)。乳腺癌患者血浆中miR200b和miR141表达水平与乳腺癌其他临床病理特征无关联(P>0.05)。见表 3。
| (x±s) | |||||||||
| Clinicopathological parameter |
MiR200b | MiR141 | |||||||
| Expressionlevel | t | P | Expressionlevel | t | P | ||||
| TNM stage |
Ⅰ-Ⅱ Ⅲ-Ⅳ |
70 12 |
－5.57±2.25 －5.78±2.44 |
0.09 | 0.769 | －6.53±2.17 －7.89±2.56 |
3.81 | 0.055 | |
| Histological grading |
Ⅰ-Ⅱ Ⅲ |
49 23 |
－5.81±2.24 －4.81±1.97 |
3.34 | 0.072 | －6.78±2.38 －6.66±2.37 |
0.04 | 0.846 | |
| ER | Positive Negative |
63 19 | －5.45±2.24 －6.10±2.33 |
1.19 | 0.278 | －6.59±2.36 －7.20±1.94 |
1.05 | 0.308 | |
| PR | Positive Negative |
56 26 | －5.45±2.25 －5.98±2.32 |
0.95 | 0.332 | －6.65±2.31 －6.91±2.20 |
0.22 | 0.639 | |
| Her-2 | Positive Negative |
21 61 | －5.35±2.61 －5.69±2.15 |
0.35 | 0.555 | －6.73±2.13 －6.73±2.33 |
0.00 | 0.999 | |
| Tumor type |
Ductal adenocarcinoma Other |
77 5 |
－5.57±2.26 －6.05±2.54 |
0.45 | 0.652 | －6.74±2.30 －6.53±1.93 |
0.20 | 0.843 | |
| Vascular invasion* | Positive Negative |
32 44 |
－5.65±2.25 －5.63±2.38 |
0.00 | 0.968 | －6.82±2.56 －6.73±2.02 |
0.03 | 0.869 | |
| Neural invasion* |
Positive Negative |
20 56 |
－5.72±2.83 －5.61±2.12 |
0.03 | 0.859 | －6.47±2.27 －6.88±2.55 |
0.49 | 0.484 | |
| *:The data of vascular invasion and neural invasion were absent in pathological data of 6 patients.Therefore, the results of 76 patients were reported on the two indicators of vascular invasion and neural invasion. | |||||||||
截止2017年8月(中位随访时间为72.4个月)，82例患者中有5例患者(6.1%)死于乳腺癌，8例患者失访，69例患者仍存活，5年生存率为96.1%。以中位数为界，将miR200家族5个成员的血浆表达水平分为低和高表达组，分析miR200家族表达水平与乳腺癌患者术后总生存期关系的结果显示:miR200家族的表达水平与乳腺癌患者术后总生存期无关联(P>0.05)。见表 4。
| microRNA | Classification1 | n | Death | 5-year survival rate | Log-rank P | HR (95%CI)2 |
| miR200a |
≤-6.13 >-6.13 |
41 41 |
3 2 |
94.6% 97.4% |
0.611 | 0.69(0.10－4.65) |
| miR200b |
≤-5.35 >-5.35 |
41 41 |
3 2 |
94.6% 97.4% |
0.551 | 0.58(0.09－3.72) |
| miR200c |
≤-4.78 >-4.78 |
41 41 |
3 2 |
94.6% 97.4% | 0.596 | 0.67(0.10－4.44) |
| miR141 |
≤-6.72 >-6.72 |
41 41 |
3 2 |
94.6% 97.4% |
0.549 | 0.65(0.09－4.30) |
| miR429 |
≤-7.00 >-7.00 |
41 41 |
2 3 |
94.4% 97.5% |
0.730 | 1.72(0.25－11.91) |
| 1：According to the median of expression level, the patients were divided into low expression group and high expression group；2：Hazard ratio(HR)was calculated after adjusted age, TNM stage, histological grading, vascular invasion, neural invasion, ER, PR and Her-2. | ||||||
在过去的20年里，全球范围内乳腺癌患者绝对数量上升了1.4倍，大多数国家和地区乳腺癌发病率升高了30%~40%[11]。在我国，乳腺癌发病率也明显升高[12]。虽然近几年在诊断技术和抗癌药物方面的研究进展迅猛，但是乳腺癌的早期诊断依然存在困难；乳腺癌患者若不能做到早期发现，将会失去手术特别是保乳手术的机会, 且辅助治疗效果相对较差, 常预后不佳。因此探索乳腺癌早期、无创诊断方法，将有助于延长患者的生存时间，改善生活质量。
2005年MISKA[13]发现：miRNAs参与细胞的分化、增殖和凋亡过程，在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用，miRNAs可作为潜在的生物标志物来评估肿瘤。miR200家族包括miR200a、miR200b、miR200c、miR141和miR4295个成员。研究[14-15]显示：miR200家族在肿瘤的发生发展过程中起抑癌基因作用，其通过抑制Suz12蛋白的形成、降低癌基因CDH1的水平、抑制肿瘤干细胞形成和干性维持而与肿瘤发生有关联。miR200家族也可通过抑制细胞周期相关基因如CDK6和PLCG1将细胞周期阻滞在G1期而影响肿瘤细胞的增殖[16]。同样，miR200家族通过作用于转录因子ZEB1和ZEB2，调节上皮细胞钙黏蛋白表达，影响上皮间质转化过程而抑制肿瘤的迁移和侵袭[17-18]。YE等[19]研究显示：miR200家族在乳腺癌组织中表达水平降低，且乳腺癌组织中表达水平较低者预后更差，乳腺癌组织中miR200的表达水平是乳腺癌预后的独立预测因素。
在循环miR200家族表达方面，ANTOLÍN等[20]对比了55例乳腺癌患者和20名对照者miR200家族表达水平发现：乳腺癌患者miR141表达水平明显降低。本研究结果显示：乳腺癌组患者血浆中miR141表达水平低于对照组，miR141用于乳腺癌诊断的AUC为0.717，与ANTOLÍN等[20]的研究结果相似。本研究结果显示：乳腺癌组患者血浆miR200b表达水平也降低，但是联用miR141和miR200b诊断乳腺癌时，AUC为0.735，准确度增加幅度较小，可能源于miR200b和miR141同作为miR200家族成员，表达有关联。
综上所述，miR200家族分子miR200b和miR141在乳腺癌患者血浆中表达水平下降，miR200b和miR141有可能作为生物学标志物用于乳腺癌的早期诊断。
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