Ⅳ型胶原(type Ⅳ collage, Col Ⅳ)是胶原性氨基酸，是由3条α肽链组成的三聚体结构，每条α链约含1 700个氨基酸残基，呈网状分布在组织中，其在动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)中的作用已成为研究的热点^[1-2]。氧化应激导致的AS斑块破裂可促进主动脉平滑肌细胞中Col Ⅳ水平的增加^[3]。研究^[4-5]发现：在AS斑块形成中，经修饰的Col Ⅳ与低密度脂蛋白的氧化有关，可能导致内皮功能的障碍，参与AS的发生发展。多肽化合物urantide是血管活性物质尾加压素Ⅱ(urotensinⅡ, UⅡ)的受体拮抗剂，其拮抗效应较其他化合物高100倍^[6-8]。本文作者前期研究^[9]显示：urantide能竞争性拮抗UⅡ对AS大鼠胸主动脉的炎症损伤作用及对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)的促丝裂作用，抑制AS的发生发展，但具体作用机制尚未阐明。有关urantide对AS大鼠胸主动脉Col Ⅳ代谢影响的有关研究尚未见报道。本研究通过探讨多肽化合物urantide对AS大鼠Col Ⅳ表达的影响，阐明其防治AS的作用机制，为临床应用urantide治疗AS提供实验依据。

SPF级雄性Wistar大鼠，体质量180~200 g，北京维通利华实验动物有限公司提供，实验动物使用许可证号：SCXK(京)-2016-0011，生产合格证号：11400700127208。urantide由苏州强耀生物公司提供，氟伐他汀(fluvastatin, Flu)购自北京诺华制药有限公司，DMEM培养基干粉和胎牛血清购自美国Gibco公司，Col Ⅳ(ELISA)试剂盒和羟脯胺酸(hydroxyproline, HYP)试剂盒购自江苏晶美生物科技有限公司，Col Ⅳ(小鼠抗大鼠)单克隆抗体购自美国RD公司，生物素标记二抗IgG、S-ABC试剂盒和DAB试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。全自动封闭组织脱水机、包埋机、石蜡切片机、组织恒温烤片机和数码显微镜购自德国莱卡公司。

高脂饲料配方：基础饲料加入3.5%胆固醇、10%猪油、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%胆酸钠及5%白糖。Wistar大鼠180只随机分为正常对照组(n=30)和AS模型组(n=150)。正常对照组大鼠每日饲以普通饲料；AS模型组大鼠实验开始时腹腔注射维生素D₃(vitamin D₃, VD₃) 150 U·kg^-1，连续3 d，每日饲以高脂饲料。实验周期为4周。AS模型复制成功后，AS组大鼠再随机分为AS组(30只)、Flu组(阳性药对照组，30只)和urantide(3、7和14 d)组(每组30只)。正常对照组和AS组大鼠每日尾静脉注射生理盐水30 μg·kg^-1，连续14 d；Flu组大鼠每日灌胃给予Flu 5 μg·kg^-1，连续14 d；urantide组大鼠每日尾静脉注射urantide 30 μg·kg^-1，给药时间分别为3、7和14 d。

采用S-ABC法对大鼠胸主动脉石蜡切片进行免疫组织化学染色，按操作说明进行。Introduction to Image-Proplus 6.0病理图像分析软件对每张切片(随机选取10个视野，×200)的免疫组织化学阳性信号进行图像分析，计算平均吸光度(A)值。以A值表示大鼠胸主动脉中Col Ⅳ的表达水平。

Wistar大鼠胸主动脉采用贴块法进行VSMC原代培养。按所加条件培养液分组：正常对照组，用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养细胞；UⅡ组，正常组细胞加入UⅡ，终浓度为10^-8 mol·L^-1；Flu组，UⅡ组细胞加入Flu，终浓度为10^-7 mmol·L^-1；urantide组，UⅡ组细胞加入urantide，终浓度为10^-10~10^-6 mol·L^-1。

采用HYP试剂盒检测各组大鼠血清和尿液中HYP水平，于酶联免疫检测仪450 nm波长处测量A值；采用Col Ⅳ(ELISA)试剂盒检测VSMC培养上清中Col Ⅳ水平，于酶联免疫检测仪490 nm波长处测量A值。根据标准曲线求出直线回归方程，计算相应的HYP和Col Ⅳ水平。

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。各组大鼠血清和尿液中HYP水平、胸主动脉和VSMC培养上清液中Col Ⅳ表达水平均以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著差法(LSD)。以P < 0.05为差异有统计学意义。

HE染色结果显示：正常对照组大鼠胸主动脉血管内皮完整，中膜可见梭形平滑肌细胞，弹力纤维层结构清晰完整；AS模型组大鼠胸主动脉内膜明显增厚，血管内皮细胞排列不完整，平滑肌细胞增生，大量泡沫细胞堆积，出现典型AS病理改变。见图 1(插页五)。

A: Normal control group; B: AS model group. 图 1 2组大鼠胸主动脉形态表现(HE，×200) Fig. 1 Morphology of thoracic aorta of rats in two groups(HE, ×200)

图选项

各组大鼠胸主动脉内膜下不规则斑块内Col Ⅳ阳性表达水平比较差异有统计学意义(F=35.09, P < 0.01)。正常对照组大鼠胸主动脉中Col Ⅳ阳性颗粒呈微量表达；AS组大鼠胸主动脉内膜下不规则斑块内Col Ⅳ阳性颗粒与正常对照组比较明显增加(P < 0.01)；urantide组Col Ⅳ阳性染色强度和范围与AS组比较均减少(P < 0.01)，urantide给药14 d时作用最明显，优于Flu组。见图 2(插页五)和3。

A: Normal control group; B: AS group; C: Flu group; D-F: Urantide group (3, 7, 14 d). 图 2 各组大鼠胸主动脉中Col Ⅳ表达（免疫组织化学，×200) Fig. 2 Expressions of Col Ⅳ in thoracic aorta of rats in various groups (Immunohistochemistry, ×200)

图选项

1:Normal control group; 2:AS group; 3:Flu group; 4-6:Urantide group(3, 7, and 14 d).*P < 0.05, **P < 0.01 compared with normal control group; △P < 0.01 compared with AS group. 图 3 各组大鼠胸主动脉中Col Ⅳ表达 Fig. 3 Expressions of Col Ⅳ in thoracic aorta of rats in various groups

图选项

HYP试剂盒检测结果显示：各组大鼠血清和尿液中HYP水平比较差异均有统计学意义(F=24.38, P < 0.01; F=26.72, P < 0.01)。与正常对照组比较，AS组大鼠血清中HYP水平明显升高(P < 0.01)，而尿液中HYP水平则明显降低(P < 0.01)。与AS组比较，urantide组不同时间大鼠血清中HYP水平均明显降低(P < 0.01)，给药7 d时降低作用最明显，接近于Flu组水平；与AS组比较，urantide组尿液中HYP水平明显升高(P < 0.01)，给药14 d时增加作用最明显，优于Flu组水平。见表 1。

各组VSMC培养上清中Col Ⅳ水平差异有统计学意义(F=31.04, P < 0.01)。与正常对照组比较，UⅡ组VSMC培养上清中Col Ⅳ水平明显升高(P < 0.01)；与UⅡ组比较，10^-9~10^-6mol·L^-1 urantide组VSMC培养上清中Col Ⅳ水平明显降低(P < 0.05或P < 0.01)，其中10^-6mol·L^-1 urantide组抑制作用接近于阳性药Flu组水平。见图 4。

1:Normal control group; 2:AS group; 3:Flu group; 4-8:10-10, 10-9, 10-8, 10-7, and 10-6 mol·L-1 urantide groups.*P < 0.05, **P < 0.01 compared with normal control group; △ P < 0.05, △△ P < 0.01 compared with AS group. 图 4 ELISA法检测各组大鼠VSMC培养上清中Col Ⅳ表达水平 Fig. 4 Levels of Col Ⅳ in VSMC culture supernatant of rats in various groups detected by ELISA method

图选项

AS是心血管系统中最常见的疾病，动脉壁胶原代谢紊乱是其发生发展的重要病因^[10-11]。国内外研究^[4-5]显示：Col Ⅳ是AS时胶原代谢紊乱的主要参与者。Col Ⅳ在AS各期的分布不同，在AS早期Col Ⅳ主要分布在泡沫细胞周围，AS晚期Col Ⅳ主要分布在动脉内膜下不规则斑块内和纤维帽下VSMC周围^[12-13]。本研究免疫组织化学结果显示：AS组Col Ⅳ阳性颗粒主要表达在大鼠胸主动脉内膜下不规则斑块内，这一结果与有关Col Ⅳ在AS晚期分布的文献^[13]报道一致。因此本文作者推测：腹腔注射VD₃联合高脂饲料饲养法可损伤大鼠胸主动脉内膜，促进中膜的VSMC合成和Col Ⅳ大量分泌，当超过机体的代偿能力时，Col Ⅳ就在动脉壁沉积，促进AS的发生发展。如何有效地抑制AS大鼠Col Ⅳ的表达，对于治疗AS具有重要的临床意义。

UⅡ最早是从鱼的脊髓尾部下垂体中分离出的生长抑素样环肽，其与G蛋白偶联受体14(G protein-coupled receptor 14, GPR14)结合后发挥生物学效应。研究^[14-15]显示：UⅡ能够促进VSMC增殖和胶原合成，促进巨噬细胞向泡沫细胞转化，与AS的发生发展有密切关系。urantide是UⅡ受体拮抗剂，可以通过阻断UⅡ与其受体GPR14的结合，起到治疗AS的作用，但具体作用机制尚未阐明^[16-18]。Col Ⅳ是AS晚期时粥样斑块的主要成分，而urantide可抑制AS的发生发展。本实验通过尾静脉注射分3、7和14 d 3个组别，连续给予urantide 30 μg·kg^-1，以观察urantide对AS大鼠Col Ⅳ表达的影响。本研究体内实验结果显示：urantide组Col Ⅳ阳性染色强度和范围与AS组比较均减少。由此表明：urantide对AS大鼠胸主动脉中膜的VSMC合成和分泌的Col Ⅳ有抑制作用。本研究采用ELISA法检测urantide对VSMC培养上清中Col Ⅳ水平的影响，结果显示：在VSMC的培养上清中，UⅡ对Col Ⅳ表达有上调作用，而urantide则对Col Ⅳ表达有下调趋势。动物水平和细胞水平的实验结果均证实urantide可抑制AS大鼠胸主动脉VSMC分泌和合成Col Ⅳ。

Col Ⅳ是由甘氨酸(glycine, Gly)、脯氨酸(proline, Pro)、HYP和羟赖氨酸等组成的胶原性氨基酸^[19]。HYP是胶原纤维所特有，占胶原蛋白13.4%，测定动物血清或尿液中HYP水平，可反映机体胶原代谢情况^[19-20]。本研究结果显示：与AS组比较，urantide组大鼠血清中HYP水平均明显降低，而尿液中HYP水平则明显升高。本文作者推测：urantide可促进动脉壁的Col Ⅳ降解加速，使血清中Col Ⅳ以HYP形式随尿液排出体外，使大鼠AS症状缓解。

综上所述，在AS发生发展过程中urantide可抑制AS大鼠胸主动脉中Col Ⅳ的分泌和合成，加速动脉壁内Col Ⅳ降解，改善AS病变程度，为临床应用urantide治疗AS提供了理论基础。