2019, Vol. 45扩展功能
文章信息
- 杨学良, 王明华, 刘艳波, 孙雪梅, 赵晓晖, 杨丽娟, 肖梓屾
- YANG Xueliang, WANG Minghua, LIU Yanbo, SUN Xuemei, ZHAO Xiahui, YANG Lijuan, XIAO Zishen
- 重组人白细胞介素17A对结肠癌细胞生长的影响及其作用机制
- Effect of recombinant human IL-17A on growth of colon cancer cells and its mechanism
- 吉林大学学报(医学版), 2019, 45(02): 258-261
- Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2019, 45(02): 258-261
- 10.13481/j.1671-587x.20190208
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文章历史
- 收稿日期: 2018-11-26
2. 北华大学基础医学院病理生理学教研室, 吉林 吉林 132013;
3. 吉林省东丰县中医院急诊科, 吉林 东丰 136300
2. Department of Pathophysiology, School of Basic Medical Sciences, Beihua University, Jilin 132012, China;
3. Department of Emergency, Dongfeng Hospital of Chinese Traditional Medicine, Jilin Province, Dongfeng 136300, China
结直肠癌作为最常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年升高的趋势，死亡率位于恶性肿瘤的第4位[1-2]。白细胞介素17A(interleukin-17A, IL-17A)作为白细胞介素17(interleukin-17, IL-17)家族的重要成员之一，参与炎症反应过程，并且与机体的免疫功能及免疫细胞有密切关联[3-4]。研究[5-9]显示:IL-17在多种恶性肿瘤，如肝癌、胃癌、结直肠癌、乳腺癌和卵巢癌等中表达水平均升高。研究[10-13]显示:IL-17A可通过调节多种信号通路进而影响癌细胞的增殖、凋亡和侵袭能力，信号通路包含信号传导及转录激活因子3(STAT3)、磷脂酰肌醇三激酶(PI3K/AKT)和IL-17/酪氨酸激酶JAK2通路。但目前国内外关于IL-17A对结肠癌增殖影响及其机制的研究少有报道。本研究观察重组人IL-17A对结肠癌SW480细胞体外增殖能力的影响，并探讨其相关机制，为临床结肠癌的诊治和药物靶点的开发提供一定的理论依据。
1 材料与方法 1.1 细胞、主要试剂和仪器结肠癌SW480细胞购自上海ATCC细胞库，细胞培养基(RPMI-1640)、胎牛血清、青-链霉素和0.25%胰蛋白酶(含EDTA)均为美国Hyclone公司产品，RIPA裂解液和BCA蛋白定量试剂盒购自北京康为世纪生物科技公司，重组人IL-17A为英国Abcam公司产品(货号：ab9567)(4℃只能保存1~2周，需保存于-20℃或-80℃，避免冻融循环)，鼠抗STAT3(货号：#9139)、鼠抗p-STAT3(货号：#4113)和鼠抗GAPDH(货号：#97166)一抗为美国Cell Signaling Technology公司产品，二抗为中杉金桥公司产品，IL-17A ELISA试剂盒购自杭州联科生物技术有限公司，ECL试剂盒为上海碧云天公司产品。ThermoFisher酶标仪为美国赛默飞世尔Thermo Scientific公司产品，Bio-Rad仪器为美国伯乐电穿孔仪。
1.2 SW480细胞株体外培养在RPMI-1640培养基中加入适量的胎牛血清和青-链霉素配置成含10%胎牛血清的细胞培养液，加入适量的SW480细胞，放置于5% CO2、37℃细胞培养箱中培养，待细胞增殖至80%~90%时采用0.25%胰蛋白酶(含EDTA)进行消化并传代，选择对数生长期的细胞进行后续实验。
1.3 细胞增殖实验将体外培养的SW480细胞分为对照组(未处理)和实验组(经IL-17A处理)，将处于对数生长期的细胞接种于96孔板中，设置第1、2、3、4和5天共5组，每组设置3个复孔。培养2~4 h细胞贴壁后加入10 μL的CKK-8试剂，轻轻敲击培养板混匀，继续培养2 h，分别检测酶标仪450 nm处的吸光度(A)值，以A值表示细胞的增殖活性，A值越大细胞增殖活性越强。
1.4 ELISA法检测SW480细胞中IL-17A水平将处于对数生长期的细胞接种于6孔板，分为对照组(未处理)和实验组(经50μg·L-1 IL-17A处理, 参考王庆生等[7]的方法)，待细胞贴壁后加入适量胰蛋白酶消化，收集细胞悬液4℃、1000 g离心10 min后弃掉培养液，加入预冷的PBS洗涤3次，加入适量的细胞裂解液(含蛋白酶抑制剂)进行重悬，于-20℃和-80℃反复冻融充分裂解，12 000 g离心15 min后，取上清。采用ELISA试剂盒检测SW480细胞中IL-17A水平，具体操作按照说明书进行，重复3次实验。
1.5 Western blotting法检测SW480细胞中STAT3相关蛋白的表达采用BCA试剂盒对2组细胞进行定量，配平后加入适量的5×Loading buffer后，100℃煮沸5 min变性，制作SDS-PAGE凝胶，加入适量的变性蛋白进行电泳，电泳完成后将蛋白转至PVDF膜，采用3%的BSA液进行封闭，TBST液洗膜后按照1:1000的比例加入相应的一抗，4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，按照1:2000加入二抗，孵育1h，TBST洗膜3次，按照ECL试剂盒进行曝光显色，重复实验3次，采用Image J软件计算各条带的灰度值，以条带的灰度值表示蛋白表达水平。
1.6 统计学分析采用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析。2组SW480细胞的增殖活性、IL-17A水平和STAT3及p-STAT3蛋白表达水平以x±s表示，符合正态分布，组间比较采用两独立样本t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 CKK-8法检测2组SW480细胞的增殖活性实验组第2、3、4和5天时细胞增殖活性均高于对照组(P < 0.05)。见表 1。
| (n=3, x±s) | |||||
| Group | Proliferation ability | ||||
| (t/d) 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| Control | 0.224±0.008 | 0.354±0.011 | 0.464±0.061 | 0.630±0.091 | 0.863±0.029 |
| Test | 0.234±0.009 | 0.455±0.017 | 0.635±0.019 | 0.862±0.020 | 1.075±0.031 |
| t | 1.438 | 8.640 | 4.636 | 4.313 | 8.650 |
| P | 0.224 | 0.001 | 0.009 | 0.013 | 0.001 |
采用ELISA法检测对照组和实验组SW480细胞中IL-17A水平，结果显示：对照组和实验组SW480细胞中IL-17A水平分别为(10.51±1.87)和(24.26±3.61) μg·L-1，2组比较差异有统计学意义(t=5.858，P=0.004)。
2.3 2组SW480细胞中STAT3和p-STAT3蛋白表达水平与对照组比较，实验组细胞中STAT3和p-STAT3蛋白表达量均升高；经过灰度分析，实验组细胞中STAT3和p-STAT3蛋白表达水平明显高于对照组(P < 0.01)。见图 1和表 2。
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| 图 1 2组SW480细胞中STAT3和p-STAT3蛋白表达电泳图 Fig. 1 Electrophoregram of expressions of STAT3 and p-STAT3 proteins in SW480 cells in two groups |
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| (n=3, x±s) | ||
| Group | STAT3 | p-STAT3 |
| Control | 0.241±0.018 | 0.225±0.014 |
| Experimental | 0.748±0.052 | 0.647±0.041 |
| t | 15.96 | 16.87 |
| P | < 0.01 | < 0.01 |
研究[14]显示：结直肠癌的不良预后与恶性肿瘤细胞的无限增殖和侵袭转移能力有密切关联。研究[15-16]显示:慢性炎症与结直肠癌的发生密切相关，可增加其发生的风险。IL-17A作为炎症因子之一，通过介导炎症反应参与恶性细胞的增殖、生长、分化和凋亡等各个过程，在肿瘤的微环境中起重要作用[17]。在健康人结肠黏膜细胞中IL-17A水平很低，在慢性炎症和实体瘤组织中其水平明显升高[18]，但是IL-17A在恶性肿瘤中的作用仍存在争议，IL-17A一方面可发挥抗肿瘤作用，抑制肿瘤生长，另一方面有促肿瘤作用，能够促进肿瘤细胞的生成、侵袭和转移[19]。由此可见，IL-17A在肿瘤中有多种作用。本研究采用IL-17A蛋白处理结肠癌SW480细胞，CKK-8法检测IL-17A对结肠癌SW480细胞增殖能力的影响，结果显示：实验组细胞的增殖能力明显高于对照组。同时本研究检测了2组SW480细胞中IL-17A水平，结果显示：经IL-17A处理后，SW480细胞中IL-17A水平明显升高，能够促进结肠癌细胞的增殖，提示IL- 17A可作为结肠癌细胞增殖的促进因子。
STAT3信号通路通过介导多个生长因子和细胞因子参与细胞的增殖、分化和凋亡过程，此信号的过度活化可引起细胞的异常增殖。在多种肿瘤，如乳腺癌、胃癌和直肠癌等肿瘤组织中STAT3信号通路激活明显[20-22]。研究[23-25]显示：IL-17可通过激活STAT3信号通路影响细胞的增殖和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)。XU等[26]发现：IL-17蛋白可通过激活STAT3信号通路参与胃癌细胞增殖；HUANG等[27]发现：IL-17可通过刺激STAT3信号通路促进肺腺癌细胞的EMT, 但关于此信号通路与结肠癌关系的研究则少有报道。本研究采用Western blotting法检测SW480细胞经IL-17A处理后STAT3和p-STAT3蛋白表达的变化，结果显示：STAT3蛋白表达水平明显升高，同时p-STAT3的表达水平也明显升高，由此可见，IL-17A可增加STAT3的表达水平，STAT3的激活与结肠癌增殖有关，提示IL-17A促进结肠癌细胞增殖可能与激活STAT3信号通路有关。
综上所述，IL-17A可能通过激活STAT3信号通路促进结肠癌细胞的增殖，IL-17A促进结肠癌细胞增殖是否存在其他信号通路参与还需进一步研究。
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