2019, Vol. 45扩展功能
文章信息
- 王馨梦, 李启阳, 刘超, 肖建英
- WANG Xinmeng, LI Qiyang, LIU Chao, XIAO Jianying
- 微球蛋白1对胃癌细胞侵袭和迁移的影响及其机制
- Effects of microspherule protein 1 on invasion and migration of gastric cancer cells and their mechanisms
- 吉林大学学报(医学版), 2019, 45(02): 251-257
- Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2019, 45(02): 251-257
- 10.13481/j.1671-587x.20190207
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文章历史
- 收稿日期: 2018-07-16
2. 锦州医科大学基础医学院发育生物学教研室, 辽宁 锦州 121001
2. Department of Developmental Biology, School of Basic Medical Sciences, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, China
胃癌是目前最常见的消化道恶性肿瘤之一，严重威胁着人类健康。临床上很多胃癌患者在手术切除前便已有转移，是导致术后转移和复发的直接原因。探讨与胃癌转移相关的因素，了解其转移机制并加以干预是治疗胃癌的有效途径[1]。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在多种癌细胞的侵袭和迁移中扮演着重要角色[2]。EMT标志物主要有上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)、神经型钙黏蛋白(N-cadherin)以及转录因子Snail。当肿瘤细胞侵袭、迁移能力增强时，E-cadherin表达水平降低，N-cadherin和Snail表达水平升高[3]。
微球蛋白1(microspherule protein 1, MCRS1)也称为MSP58(58000 microspherule protein)，既往研究[4-7]显示：MCRS1在乳腺癌、肠癌和食管癌组织及细胞中高表达，在结直肠癌中其表达水平明显高于正常癌旁组织[8]。敲低MCRS1可明显抑制胃癌MGC803细胞和BGC823细胞的增殖，MCRS1对胃癌细胞的增殖具有促进作用[9]，在众多癌细胞中MCRS1被认为是癌基因[10-11]。但最新研究[12]显示：MCRS1蛋白通过抑制端粒酶活性，从而抑制胃癌患者的淋巴转移。由此可见，MCRS1具有促癌和抑癌的双重特质。基于MCRS1在肿瘤中的特殊双重作用，为探讨其在胃癌发生发展中的作用，本实验通过检测MCRS1在胃癌细胞中的表达情况，选取低表达的细胞株进行上调实验，探讨过表达MCRS1对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响及可能的作用机制。
1 材料与方法 1.1 细胞、主要试剂和仪器胃癌BGC-823细胞、SGC-7901细胞和正常胃黏膜上皮GES-1细胞(上海吉凯基因化学技术有限公司)。dNTP和感受态DH5α(TaKaRa公司，中国)，Lipo 3000(Invitrogen公司，美国)，MCRS1抗体(Abcam公司，美国)，E-cadherin抗体、N-cadherin抗体、Snail抗体、β-actin抗体和HRP标记的山羊抗兔IgG(ABclonal公司，中国)，BCA蛋白浓度测定试剂盒、细胞裂解液和ECL化学发光试剂(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，中国)，质粒小量提取试剂盒和胶回收试剂盒(爱思进生物技术有限公司，中国)。Matrigel基质胶和Transwell小室(BD公司，美国)，PCR扩增仪(Mastercycler nexus X2, Eppendorf公司，德国)，CO2培养箱(Heraeus公司，德国)，凝胶自动成像仪(Uiltralum公司，美国)，水浴式电转印槽、电泳仪和电泳槽(Bio-Rad公司，美国)。
1.2 重组质粒pcDNA3.1-myc-MCRS1的构建 1.2.1 人MCRS1全长序列的扩增根据人MCRS1(Genebank ID:NM_001012300)序列，设计特异性PCR引物，上游引物加Hind Ⅲ酶切位点，下游引物加XbaⅠ酶切位点和终止密码子。引物由中美泰和生物技术(北京)有限公司合成，引物序列如下：上游序列为5′-GGCGGAAGCTTCCACCATGGACAAAGATTCTCAGGGGC-3′，下游序列为5′-GGCGGTCTAGACTGTGGTGTGATCTTGGCAGCC-3′。PCR反应体系50 μL，反应条件：94℃、7 min；94℃、45 s，55℃、30 s，72℃、3 min，35个循环；72℃、10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后回收并纯化凝胶。
1.2.2 pcDNA3.1-myc-MCRS1重组质粒的构建和鉴定PCR纯化产物和pcDNA3.1载体先用Hind Ⅲ酶切，37℃孵育3 h，将酶切产物纯化后再用XbaⅠ酶切孵育3 h，胶回收纯化后用T4连接酶与pcDNA3.1连接，16℃恒温过夜。取1 μL连接产物转化到感受态细胞DH5α中，37℃、180 r·min－1振荡1 h。取50 μL菌液涂布于含有氨苄霉素的琼脂平板上，37℃倒置培养24 h。挑取单克隆后再摇菌过夜。采用质粒小量提取试剂盒提取质粒后用HindⅢ和XbaⅠ酶切鉴定，选择酶切片段大小与预期相符的阳性克隆，送至中美泰和生物技术(北京)有限公司进行检测，将结果完全正确的重组质粒扩增培养，去内毒素处理后分装，于－4℃条件下保存。
1.3 细胞培养与转染采用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基(含有100 U·L-1青霉素和50 mg·L-1链霉素)培养人胃癌BGC-823细胞、胃癌SGC-7901细胞和人胃黏膜上皮GES-1细胞。培养条件为含5% CO2细胞培养箱，37℃培养。细胞达到约80%融合时进行传代。质粒转染参照Lipo3000转染试剂盒说明书进行。实验分为空白组(未做转染处理)、空载体转染组(转染pcDNA3.1空载体)和MCRS1转染组(转染pcDNA3.1-myc-MCRS1质粒)，转染后培养48 h收集细胞，进行后续实验。
1.4 Western blotting法检测各组细胞中MCRS1蛋白表达和侵袭相关蛋白表达水平收集各组细胞，蛋白裂解液提取细胞总蛋白，进行8% ~ 12% SDS-PAGE电泳分离，将蛋白转移至PVDF膜上，用含1% BSA的TBST封闭2 h，分别与稀释后一抗(MCRS1抗体、E-cadherin抗体、N-cadherin抗体和Snail抗体)4℃孵育16~18 h。TBST洗膜3次后，采用HRP偶联的IgG二抗(稀释比1:2 000)室温温育1.5 h，摇床上洗膜3次后显影。采用Image J软件计算蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值。
1.5 细胞划痕实验检测胃癌细胞迁移能力将BGC-823细胞接种于6孔板，细胞转染后继续培养24 h，采用黄色枪头划痕，PBS清洗细胞3次，使用显微镜观察同一位置不同时间点(0、12、24、36和48 h)划痕宽度变化情况并拍照，采用Image J测量3组细胞划痕面积，并计算迁移率，以12 h细胞迁移率计算为例，迁移率=(0 h划痕面积－12 h划痕面积)/ 0 h划痕面积×100%。
1.6 Transwell实验检测胃癌细胞迁移和侵袭能力将100 μL稀释好的Martrigel基质胶均匀铺于Transwell小室底部，37℃培养箱中放置1 h, 取出后吸取上层液体并弃去(铺胶检测细胞侵袭能力，不铺胶检测细胞迁移能力)。接种5 ×104个细胞于Trans签拭去小室上层细胞，PBS缓冲液清洗小室上层3次，自然风干后向小室下腔加入600 μL多聚甲醛固定液，固定10 min后，用PBS缓冲液清洗小室下腔2次。向小室下腔加入600 μL结晶紫染液，染色10 min，用PBS洗3次，洗净结晶紫。将小室置于200倍光学显微镜下观察并随机选取5个视野计算细胞总数，取平均值作为该次实验结果。
1.7 统计学分析采用Graphpad prism 7统计软件进行统计学分析。各组细胞中蛋白表达水平、细胞迁移率、细胞迁移数量和细胞侵袭数量以x±s表示，组间比较采用方差分析方法。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 MCRS1重组质粒鉴定设计特异MCRS1引物，通过PCR扩增出目的条带，目的基因为1785 bp(图 1A)。将胶回收后的目的基因与pcDNA3.1载体连接，构建pcDNA3.1-myc-MCRS1质粒。酶切鉴定重组质粒pcDNA3.1-myc-MCRS1，得到与PCR扩增产物大小一致的片段(图 1B)。
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| A:Construction; M1:1500 bp Marker; Lane 1, 2:MCRS1.B:Identification; Lane 1, 2:pcDNA3.1-myc-MCRS1;M2:5000 bp Marker. 图 1 pcDNA3.1-myc-MCRS1质粒构建和鉴定电泳图 Fig. 1 Electrophoregram of construction and identification of pcDNA3.1-myc-MCRS1 plasmid |
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MCRS1蛋白在BGC-823细胞中表达水平最低，为0.680±0.003；其次是在GES-1细胞，为0.826±0.005；在SGC-7901细胞中表达水平最高，为1.446±0.006。见图 2。因此，选择MCRS1本体表达水平低的胃癌BGC-823细胞进行后续转染实验。
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| Lane 1:GES-1 cells; Lane 2:SGC-7901 cells; Lane 3:BGC-823 cells. 图 2 Western blotting法检测MCRS1蛋白在GES-1、SGC-7901和BGC-823细胞中表达电泳图 Fig. 2 Electrophoregram of expressions of MCRS1 protein in GES-1, SGC-7901 and BGC-823 cells detected by Western blotting method |
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细胞划痕实验中，BGC-823细胞转染MCRS1后12、24、36和48 h，MCRS1转染组细胞迁移数量少于空白组和空载体转染组(图 3)，划痕相对距离较远，迁移率低于空白组和空载转染组(P < 0.01)。见图 4。
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| 图 3 各组胃癌细胞BGC-823的迁移情况 Fig. 3 Migration of gastric cancer BGC-823 cells in various groups |
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| *P < 0.01 compared with blank group; △P < 0.01 compared with empty vector transfection group. 图 4 各组胃癌BGC-823细胞的迁移率 Fig. 4 Migration rates of gastric cancer BGC-823 cells in various groups |
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Transwell小室实验中，BGC-823细胞转染pcDNA 3.1-myc-MCRS1 24 h后，MCRS1转染组细胞穿过小室数量明显少于空白组和空载体转染组(P < 0.01)，细胞迁移数量和侵袭数量远低于空白组和空载体转染组(P < 0.01)。见图 5(插页三)和6。
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| A-C:Migration; D-F:Invasion; A, D: Blank group; B, E: Empty vector transfection group; C, F: MCRS1 transfection group. 图 5 Transwell实验检测各组胃癌细胞BGC-823迁移和侵袭情况(结晶紫，×200) Fig. 5 Migration and invasion of gastric cancer BGC-823 cells in various groups detected with Transwell assay(Crystal violet, ×200) |
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| 1: Blank group; 2: Empty vector transfection group; 3: MCRS1 transfection group. 图 6 各组胃癌BGC-823细胞迁移(A)和侵袭(B)细胞数量 Fig. 6 Number of migration(A) and invasion(B) cells of gastric cancer BGC-823 cells in various groups |
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与空白组(0.657±0.023)和空载体转染组(0.591±0.025)比较，MCRS1转染组细胞中MCRS1蛋白表达水平(1.165±0.054)明显升高(P < 0.01)，说明转染成功，见图 7和表 1。MCRS1转染组细胞中E-cadherin蛋白表达水平(0.948±0.027)明显高于空白组(0.529±0.023)和空载体转染组(0.532±0.012)(P < 0.01)。MCRS1转染组细胞中N-cadherin蛋白表达水平(0.578±0.006)明显低于空白组(1.038±0.008)和空载体转染组(1.110±0.018)(P < 0.01)。MCRS1转染组Snail蛋白表达水平(0.487±0.008)明显低于空白组(1.044±0.015)和空载体转染组(1.047±0.012)(P < 0.01)。见图 8和表 1。
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| Lane 1: Blank group; Lane 2: Empty vector transfection group; Lane 3: MCRS1 transfection group. 图 7 Western blotting法检测各组细胞中MCRS1蛋白表达电泳图 Fig. 7 Electrophoregram of expressions of MCRS1 protein in cells in various groups detected by Western blotting method |
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| (x±s) | ||||
| Group | MCRS1/β-actin | E-cadherin/β-actin | N-cadherin /β-actin | Snail/β-actin |
| Blank | 0.657±0.023 | 0.529±0.023 | 1.038±0.008 | 1.044±0.015 |
| Empty vector transfection | 0.591±0.025 | 0.532±0.012 | 1.110±0.018 | 1.047±0.012 |
| MCRS1 transfection | 1.165±0.054*△ | 0.948±0.027*△ | 0.578±0.006*△ | 0.487±0.008*△ |
| *P < 0.01 compared with blank group; △P < 0.01 compared with empty vector transfection group. | ||||
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| Lane 1: Blank group; Lane 2: Empty vector transfection group; Lane 3: MCRS1 transfection group. 图 8 Western blotting法检测各组细胞中E-cadherin、N-cadherin和Snail蛋白表达电泳图 Fig. 8 Electrophoregram of expressions of E-cadherin, N-cadherin and Snail proteins in cells in various groups detected by Western blotting method |
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MCRS1全长462个氨基酸，主要定位在核仁和中心体[13]。MCRS1在恶性肿瘤发展、淋巴结转移过程及患者生存情况方面发挥重要作用。研究[4-9]显示：下调MCRS1表达可抑制乳腺癌、肠癌、食管癌、结直肠癌和胃癌细胞的生长和增殖，但MCRS1蛋白又可抑制胃癌患者的淋巴转移，说明MCRS1具有抑癌和促癌的双重特质[12]。MCRS1在胃癌细胞的迁移和侵袭方面充当何种角色目前尚不明确。本研究选择胃癌BGC-823细胞、SGC-7901细胞和正常胃黏膜上皮细胞GES-1，采用Western blotting方法检测到MCRS1蛋白在胃癌BGC-823细胞中低表达，因此选择BGC-823细胞进行后续过表达实验。随后构建重组质粒pcDNA3.1-myc-MCRS1，采用瞬时转染技术将质粒转入BGC-823细胞，Western blotting法检测显示：与空白组和空载体转染组比较，MCRS1转染组E-cadherin蛋白表达水平升高，N-cadherin和Snail蛋白表达水平降低。划痕实验和Transwell小室实验则证实上调MCRS1表达明显抑制胃癌细胞的迁移和侵袭，与CUI等[9]对胃癌MGC803细胞和BGC-823细胞的研究结果有所不同，原因可能是不同实验室细胞遗传背景存在差异，且由于其特殊的抑癌和致癌双重作用，导致其在不同细胞中影响不同[12]。为了进一步验证本实验结果，本文作者将在MCRS1本体表达水平高的SGC-7901细胞中进行下调实验，从正反两方面验证MCRS1在胃癌发展中的作用，从而达到实验的严谨性。
EMT现象是指上皮细胞在特定的生理和病理情况下，向间质细胞表型转化，同时伴随有细胞形态和细胞功能的改变[14]。肿瘤细胞浸润和转移涉及许多不同的过程，EMT作为其中关键的步骤，被认为是癌症侵袭和转移的重要环节[15]。鉴于EMT标志物E-cadherin、N-cadherin以及转录因子Snail在促进胃癌转移和侵袭中的作用，因此检测转移过程中三者的表达水平，探讨其是否可作为胃癌转移的早期诊断指标。E-cadherin作为一种钙依赖性跨膜黏附蛋白，是黏附蛋白的核心组件，能够抑制肿瘤细胞浸润和转移，甚至是一种抑癌基因[16]。研究[17]显示：在上皮细胞中N-cadherin可使细胞形态向成纤维细胞转化，从而使这些细胞富有活力与侵袭性，N-cadherin的作用之一是提高细胞的移动能力，因此当肿瘤细胞中的N-cadherin表达水平升高时，表明其获得了更强的侵袭以及转移能力。而Snail家族成员具有促进细胞转移的作用，在许多肿瘤组织中存在高表达，被视为肿瘤侵袭和转移的促进因素[18-20]。在本研究中，上调MCRS1之后，E-cadherin蛋白表达水平升高，N-cadherin和Snail蛋白表达水平降低，提示MCRS1对胃癌细胞侵袭和转移有抑制作用。
综上所述，本实验验证了过表达MCRS1可以明显抑制胃癌细胞的侵袭和迁移，其机制可能与E-cadherin蛋白表达增加、N-cadherin及Snail蛋白表达减少有关。在本研究基础上，本文作者还将通过更多的实验探讨MCRS1抑制胃癌进展和转移的机制，为临床上胃癌的分子治疗提供新的理论依据及治疗策略，提高胃癌患者的生存率，达到预防和治疗胃癌并防止其复发的目的。
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